论文部分内容阅读
[提要]目的：探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对软骨细胞分泌糖胺多糖的作用。方法：通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞，定量接种5×106个细胞于培养皿，在传代细胞培养皿中加入100 μg/L 的IGF-1，每周传代1次，连续4周，留取培养液，用阿利新蓝法（Alcian Blue）测定软骨细胞糖胺多糖（GAG）的变化；利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果：软骨细胞从传代后开始合成糖胺多糖，第二代传代细胞分泌GAG的能力最强； 浓度为100μg/ml的IGF-1能明显促进传代软骨细胞合成糖胺多糖。结论：IGF-1能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖。
[关键词]软骨细胞；细胞培养；胰岛素样生长因子；糖胺多糖
[中图分类号]Q813.1 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2015）09-0034-03
Abstract： Objective To explore the effect of Insulin-like growth factor 1（IGF-1） on the synthesis of glycosaminoglycan（GAG） in pig articular chondrocytes. Methods The articular cartilage of pig were digested by collagenase II and the chondrocytes were collected，5×106/ ml /ml cells were planted in culture dish.The cells were cultured with the medium including100μg/L Insulin-like growth factor 1（IGF-1） for up to 4 weeks and the medium were collected per week，none IGF-1 as control.Alcian blue chromatomery was used to detect the change of glycosaminoglycan （GAG） in the medium.The articular chondrocytes were observed under light microscope.5×106/ ml chondrocytes were seeded onto the cell-scaffold complex which was formed by PGA high molecular polymer scaffold coated with polylactic acid （PLA），and we observed the complex by scanning electron microscope （SEM）. Results The primary and secondary chondrocytes grew well.The chondrocyes treated by IGF-1 synthesized more GAG compared to the control from 1st to 4th weeks after being subcultured.And the secondary chondrocytes synthesized most GAG. Conclusion Insulin-like growth factor 1 could increase the synthesis of the GAG of chondrocytes.
Key words：chondrocyte；cell culture； insulin-like growth factor 1（IGF-1）；glycosaminoglycan
骨关节炎疾病和外伤可导致软骨的缺损，软骨细胞属于增生能力很弱的终末细胞，自身修复能力很弱[1-2]。经体外消化获得的软骨细胞能够在合适的环境中生长、繁殖，利用可降解的生物相容性支架为软骨细胞提供营养交换空间，就可获得足够用于修复的具有三维特定形状的组织工程化软骨组织。软骨组织工程的兴起为软骨缺损的修复提供了良好的应用前景，体外培养的软骨细胞是研究生长因子对软骨细胞促进或抑制作用的一种良好的实验模型。
近来许多新的实验证明，多种生长因子在软骨损伤后的修复中起着极为重要的作用，其中胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor，IGF）在软骨的生长、发育、分化、骨化过程中有重要的调节作用[3]。本研究对体外培养的关节软骨细胞分泌的糖胺多糖进行连续定量检测，探讨IGF-1促进软骨细胞生长、分化和增值的作用机制，为IGF-1在组织工程化软骨修复软骨缺损中的临床应用及骨关节炎的治疗提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 动物与试剂
1.1.1 实验动物： 贵州香猪（购自上海市第九人民医院动物实验室），体重4.5～5.5kg，雄性。
1.1.2 试剂： 10%胎牛血清，F12细胞培养基，0.15%的Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司），0.25%的胰蛋白酶和胰岛素样生长因子1（美国Sigma公司）。
1.2 生物支架和细胞培养液的制备
将PGA纤维制成大小约4mm×3mm厚圆柱形，加PLA浓液塑形，待自然干燥成型，形成支架，用硫酸盐缓冲液冲洗3遍，紫外线消毒，备用。在DMEM加入青霉素100μ/ml、谷氨酰胺300mg、链霉素100μg/ml、VitC50mg，加入10%胎牛血清，调调pH值为7.0左右，过滤消毒，备用。
1.3 猪关节软骨细胞的提取[4-7] 1.3.1 软骨组织的取材：小猪静脉麻醉后，在无菌操作下切取股骨远端、胫骨近端的软骨，75%酒精浸泡30min后，将软骨组织剪成1mm3左右的方块，置于离心管中，用PBS液冲洗3次。
1.3.2 消化：在盛有软骨碎块的离心管中加入2倍体积0.2%Ⅱ型胶原酶，放置37℃的恒温振荡床中振荡、消化。
1.3.3 收集细胞：3～4h后第一次收集软骨细胞。将悬浊液过滤筛滤去软骨组织，隔夜消化，第二天早上收集。过滤的液体离心，吸除消化液，加入PBS液，漂洗3次，加入细胞培养液6ml，振荡混和制成细胞悬液。锥虫蓝拒染实验观察软骨细胞的活力。
1.4 倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况
将软骨细胞悬液以5×106/ml密度定量接种于经PLA包埋PGA支架上，形成软骨细胞支架复合体，培养1周，扫描电镜观察软骨细胞生长情况。
1.5 扫描电镜下观察软骨细胞生长情况
1.6 软骨细胞的培养和传代
将软骨细胞悬液密度调整为5×106/ml，以1 ml分别接种于塑料培养皿，加入6ml培养液（F-12培养液加10%胎牛血清），置入37℃恒温培养箱（5% CO2）培养。经清洗、消化、过滤、离心收集，用血细胞计数板计数，HamsF-12培养液稀释为5×106/ml，以1ml分别接种到培养皿内，加入6ml培养液，置于37℃恒温培养箱（5%CO2）内培养，倒置显微镜镜下观察细胞形态及活力。细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察软骨细胞70%～80%汇合，即进行传代。原代细胞经过消化、过滤、收集，用血球记数板计数，F-12培养液稀释为5×106/ml，以1ml分别接种到培养皿内，加入6ml培养液，置入37℃恒温培养箱（5% CO2）继续培养。每周传代1次，连续4周。
1.7 实验分组
将软骨细胞悬液浓度为5×106/ ml，以1ml分别接种到培养皿内，对照组加入6ml培养液，实验组在对照组的基础上细胞培养液中加入浓度为100 μg/L的IGF-1，软骨细胞每周传代一次，连续4周，收集各组每周培养液标本，定量检测GAG的含量。
1.8 软骨细胞糖胺多糖（GAG）的定量检测
阿利新蓝法测定软骨细胞培养液中GAG的含量。定量接种5×106个细胞放置培养皿中，每周传代一次，留取所有培养液进行检测。吸1ml培养液，加入1.5%阿利新蓝溶液1.5ml，常温放置10min，480nm比色，4-硫酸软骨素作为标准溶液，绘制标准曲线。根据标准曲线求得样本GAG含量。
1.9 统计学处理
应用Microsoft Excel5.0统计软件包检验。计量资料用x±s表示。实验组与对照组糖氨多糖含量的比较采用配对资料t检验。
2 结果
2.1显微镜观察关节软骨细胞的生长情况
刚分离出的软骨细胞呈圆形，有较强折光性。贴壁时间平均为10h，延伸时间约24h，7d左右形成单层细胞，细胞排列紧密，呈多角形（图1）。传代后，软骨细胞贴壁时间平均为3h，延伸时间约7h。连续培养至第6周，见细胞形态向成纤维细胞型转化，呈梭形，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴，增殖速度减慢。
2.2 扫描电镜观察软骨细胞生长情况
软骨细胞接种于PLA包埋PGA的支架上，培养7d，扫描电镜观察，细胞聚集呈膜片状，软骨细胞分泌基质旺盛，软骨细胞与支架粘附良好，中央不透明为大量细胞层叠，与支架粘附生长（图2）。
2.3 软骨细胞GAG含量测定
每组样本各10例，测其不同时段软骨细胞GAG的含量，见表1。
3 讨论
胰岛素样生长因子1是一类多功能的细胞因子，可调节蛋白质和糖原的合成与分解，参与细胞的增殖、分化及凋亡过程[8]。有研究发现胰岛素样生长因子1可通过MAPK/ERK 信号通路促进软骨细胞增殖[9]，在软骨的修复重建过程中发挥重要作用。魏立等[10]的实验表明浓度为100μg/L的胰岛素样生长因子1能促进大鼠细胞增殖，抑制其凋亡。肖飞等[11]的实验发现胰岛素样生长因子1对创伤性关节炎模型兔软骨细胞形态的影响。
本实验研究表明：软骨细胞从传代第一周开始合成大量的糖胺多糖，第二代传代细胞分泌糖胺多糖的能力最强，传代第三周后，糖胺多糖含量降低，软骨细胞增殖能力减退。本实验证实了浓度为100μg/L的IGF-1能明显促进传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖，表明胰岛素样生长因子1对软骨细胞的增殖有明显的促进作用。
体外培养的软骨细胞增殖能力低下限制了组织工程化软骨的研究。作为一种种子细胞，体外培养的软骨细胞增值必须达到足够的数量才有可能生成软骨[12-13]。本实验为IGF-1在组织工程化软骨修复软骨缺损中的临床应用及骨关节炎的治疗提供理论基础。
[参考文献]
[1]朱宝玉，王万春，唐新桥.创伤性关节炎发病机制研究进展[J].国际骨科学杂志，2007，4（28）：245-247.
[2]陈飞飞，田清业，张祚勇，等.关节软骨缺损修复的研究进展[J].中国骨与关节杂志，2012，1（6）：509-512.
[3]付勤，肖逸鹏，王志为，等.生长因子促成年兔关节软骨细胞增殖的研究[J].中国修复重建外科杂志， 2002， 16（4）：219- 222.
[4]王传家，李宇，许宏权，等.猪软骨细胞外分泌基质功能检测的实验研究[J].汕头大学医学院学报，2000，13（2）：22-23.
[5]王传家，李宇，许宏权，等.一氧化氮对兔关节软骨细胞凋亡的影响[J].实用美容整形外科杂志，2002， 13（6）：324-326.
[6]王传家，王海鱼，许红权，等.bFGF对猪关节软骨细胞合成氨基葡聚糖的作用[J].中国美容医学，2006，15（7）：782-783.
[7]王传家，王海鱼，许红权，等.改良猪耳廓软骨细胞体外培养的实验研究[J].中国美容医学，2007，16（5）：607-608.
[8]Higgins TF， Johnson BD. Effect of exogenous IGF-1 onchondrocyte apoptosis in a rabbit intraarticular osteotomymodel[J].J Orthop Res，2010，28（1）：125-130.
[9]Zhang M，Zhou Q，Liang QQ，et al.IGF-1 regulation of type II collagen and MMP-13 expression in rat endplate chondrocytes via distinct signaling pathways[J].Osteoarthritis Cartilage， 2009；17（1）：100-106.
[10]魏立，江莉婷，周琦，等.大鼠髁突软骨细胞凋亡与胰岛素样生长因子1的影响[J].中国组织工程研究，2013，17（33）： 5901-5908.
[11]肖飞，陈聚伍，王福建，等.胰岛素样生长因子-1在家兔骨折愈合过程中的作用[J].中华实验外科杂志，2013，30（9）：1936-1938.
[12]Barbero A，Grogan S，Schfer D，et al.Age related changes in human articular chondrocyte yield，proliferation and post-expansion chondrogenic capacity[J].Osteoarthritis Cartilage，2004，12（6）：476-484.
[13]赵广，荆吉峰，张治宇，等.胰岛素样生长因子1促进创伤性关节炎软骨细胞的体外增殖[J].中国组织工程研究，2014，18（2）：183-186.
[收稿日期]2015-03-05 [修回日期]2015-05-13
编辑/张惠娟
[关键词]软骨细胞；细胞培养；胰岛素样生长因子；糖胺多糖
[中图分类号]Q813.1 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2015）09-0034-03
Abstract： Objective To explore the effect of Insulin-like growth factor 1（IGF-1） on the synthesis of glycosaminoglycan（GAG） in pig articular chondrocytes. Methods The articular cartilage of pig were digested by collagenase II and the chondrocytes were collected，5×106/ ml /ml cells were planted in culture dish.The cells were cultured with the medium including100μg/L Insulin-like growth factor 1（IGF-1） for up to 4 weeks and the medium were collected per week，none IGF-1 as control.Alcian blue chromatomery was used to detect the change of glycosaminoglycan （GAG） in the medium.The articular chondrocytes were observed under light microscope.5×106/ ml chondrocytes were seeded onto the cell-scaffold complex which was formed by PGA high molecular polymer scaffold coated with polylactic acid （PLA），and we observed the complex by scanning electron microscope （SEM）. Results The primary and secondary chondrocytes grew well.The chondrocyes treated by IGF-1 synthesized more GAG compared to the control from 1st to 4th weeks after being subcultured.And the secondary chondrocytes synthesized most GAG. Conclusion Insulin-like growth factor 1 could increase the synthesis of the GAG of chondrocytes.
Key words：chondrocyte；cell culture； insulin-like growth factor 1（IGF-1）；glycosaminoglycan
骨关节炎疾病和外伤可导致软骨的缺损，软骨细胞属于增生能力很弱的终末细胞，自身修复能力很弱[1-2]。经体外消化获得的软骨细胞能够在合适的环境中生长、繁殖，利用可降解的生物相容性支架为软骨细胞提供营养交换空间，就可获得足够用于修复的具有三维特定形状的组织工程化软骨组织。软骨组织工程的兴起为软骨缺损的修复提供了良好的应用前景，体外培养的软骨细胞是研究生长因子对软骨细胞促进或抑制作用的一种良好的实验模型。
近来许多新的实验证明，多种生长因子在软骨损伤后的修复中起着极为重要的作用，其中胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor，IGF）在软骨的生长、发育、分化、骨化过程中有重要的调节作用[3]。本研究对体外培养的关节软骨细胞分泌的糖胺多糖进行连续定量检测，探讨IGF-1促进软骨细胞生长、分化和增值的作用机制，为IGF-1在组织工程化软骨修复软骨缺损中的临床应用及骨关节炎的治疗提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 动物与试剂
1.1.1 实验动物： 贵州香猪（购自上海市第九人民医院动物实验室），体重4.5～5.5kg，雄性。
1.1.2 试剂： 10%胎牛血清，F12细胞培养基，0.15%的Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司），0.25%的胰蛋白酶和胰岛素样生长因子1（美国Sigma公司）。
1.2 生物支架和细胞培养液的制备
将PGA纤维制成大小约4mm×3mm厚圆柱形，加PLA浓液塑形，待自然干燥成型，形成支架，用硫酸盐缓冲液冲洗3遍，紫外线消毒，备用。在DMEM加入青霉素100μ/ml、谷氨酰胺300mg、链霉素100μg/ml、VitC50mg，加入10%胎牛血清，调调pH值为7.0左右，过滤消毒，备用。
1.3 猪关节软骨细胞的提取[4-7] 1.3.1 软骨组织的取材：小猪静脉麻醉后，在无菌操作下切取股骨远端、胫骨近端的软骨，75%酒精浸泡30min后，将软骨组织剪成1mm3左右的方块，置于离心管中，用PBS液冲洗3次。
1.3.2 消化：在盛有软骨碎块的离心管中加入2倍体积0.2%Ⅱ型胶原酶，放置37℃的恒温振荡床中振荡、消化。
1.3.3 收集细胞：3～4h后第一次收集软骨细胞。将悬浊液过滤筛滤去软骨组织，隔夜消化，第二天早上收集。过滤的液体离心，吸除消化液，加入PBS液，漂洗3次，加入细胞培养液6ml，振荡混和制成细胞悬液。锥虫蓝拒染实验观察软骨细胞的活力。
1.4 倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况
将软骨细胞悬液以5×106/ml密度定量接种于经PLA包埋PGA支架上，形成软骨细胞支架复合体，培养1周，扫描电镜观察软骨细胞生长情况。
1.5 扫描电镜下观察软骨细胞生长情况
1.6 软骨细胞的培养和传代
将软骨细胞悬液密度调整为5×106/ml，以1 ml分别接种于塑料培养皿，加入6ml培养液（F-12培养液加10%胎牛血清），置入37℃恒温培养箱（5% CO2）培养。经清洗、消化、过滤、离心收集，用血细胞计数板计数，HamsF-12培养液稀释为5×106/ml，以1ml分别接种到培养皿内，加入6ml培养液，置于37℃恒温培养箱（5%CO2）内培养，倒置显微镜镜下观察细胞形态及活力。细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察软骨细胞70%～80%汇合，即进行传代。原代细胞经过消化、过滤、收集，用血球记数板计数，F-12培养液稀释为5×106/ml，以1ml分别接种到培养皿内，加入6ml培养液，置入37℃恒温培养箱（5% CO2）继续培养。每周传代1次，连续4周。
1.7 实验分组
将软骨细胞悬液浓度为5×106/ ml，以1ml分别接种到培养皿内，对照组加入6ml培养液，实验组在对照组的基础上细胞培养液中加入浓度为100 μg/L的IGF-1，软骨细胞每周传代一次，连续4周，收集各组每周培养液标本，定量检测GAG的含量。
1.8 软骨细胞糖胺多糖（GAG）的定量检测
阿利新蓝法测定软骨细胞培养液中GAG的含量。定量接种5×106个细胞放置培养皿中，每周传代一次，留取所有培养液进行检测。吸1ml培养液，加入1.5%阿利新蓝溶液1.5ml，常温放置10min，480nm比色，4-硫酸软骨素作为标准溶液，绘制标准曲线。根据标准曲线求得样本GAG含量。
1.9 统计学处理
应用Microsoft Excel5.0统计软件包检验。计量资料用x±s表示。实验组与对照组糖氨多糖含量的比较采用配对资料t检验。
2 结果
2.1显微镜观察关节软骨细胞的生长情况
刚分离出的软骨细胞呈圆形，有较强折光性。贴壁时间平均为10h，延伸时间约24h，7d左右形成单层细胞，细胞排列紧密，呈多角形（图1）。传代后，软骨细胞贴壁时间平均为3h，延伸时间约7h。连续培养至第6周，见细胞形态向成纤维细胞型转化，呈梭形，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴，增殖速度减慢。
2.2 扫描电镜观察软骨细胞生长情况
软骨细胞接种于PLA包埋PGA的支架上，培养7d，扫描电镜观察，细胞聚集呈膜片状，软骨细胞分泌基质旺盛，软骨细胞与支架粘附良好，中央不透明为大量细胞层叠，与支架粘附生长（图2）。
2.3 软骨细胞GAG含量测定
每组样本各10例，测其不同时段软骨细胞GAG的含量，见表1。
3 讨论
胰岛素样生长因子1是一类多功能的细胞因子，可调节蛋白质和糖原的合成与分解，参与细胞的增殖、分化及凋亡过程[8]。有研究发现胰岛素样生长因子1可通过MAPK/ERK 信号通路促进软骨细胞增殖[9]，在软骨的修复重建过程中发挥重要作用。魏立等[10]的实验表明浓度为100μg/L的胰岛素样生长因子1能促进大鼠细胞增殖，抑制其凋亡。肖飞等[11]的实验发现胰岛素样生长因子1对创伤性关节炎模型兔软骨细胞形态的影响。
本实验研究表明：软骨细胞从传代第一周开始合成大量的糖胺多糖，第二代传代细胞分泌糖胺多糖的能力最强，传代第三周后，糖胺多糖含量降低，软骨细胞增殖能力减退。本实验证实了浓度为100μg/L的IGF-1能明显促进传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖，表明胰岛素样生长因子1对软骨细胞的增殖有明显的促进作用。
体外培养的软骨细胞增殖能力低下限制了组织工程化软骨的研究。作为一种种子细胞，体外培养的软骨细胞增值必须达到足够的数量才有可能生成软骨[12-13]。本实验为IGF-1在组织工程化软骨修复软骨缺损中的临床应用及骨关节炎的治疗提供理论基础。
[参考文献]
[1]朱宝玉，王万春，唐新桥.创伤性关节炎发病机制研究进展[J].国际骨科学杂志，2007，4（28）：245-247.
[2]陈飞飞，田清业，张祚勇，等.关节软骨缺损修复的研究进展[J].中国骨与关节杂志，2012，1（6）：509-512.
[3]付勤，肖逸鹏，王志为，等.生长因子促成年兔关节软骨细胞增殖的研究[J].中国修复重建外科杂志， 2002， 16（4）：219- 222.
[4]王传家，李宇，许宏权，等.猪软骨细胞外分泌基质功能检测的实验研究[J].汕头大学医学院学报，2000，13（2）：22-23.
[5]王传家，李宇，许宏权，等.一氧化氮对兔关节软骨细胞凋亡的影响[J].实用美容整形外科杂志，2002， 13（6）：324-326.
[6]王传家，王海鱼，许红权，等.bFGF对猪关节软骨细胞合成氨基葡聚糖的作用[J].中国美容医学，2006，15（7）：782-783.
[7]王传家，王海鱼，许红权，等.改良猪耳廓软骨细胞体外培养的实验研究[J].中国美容医学，2007，16（5）：607-608.
[8]Higgins TF， Johnson BD. Effect of exogenous IGF-1 onchondrocyte apoptosis in a rabbit intraarticular osteotomymodel[J].J Orthop Res，2010，28（1）：125-130.
[9]Zhang M，Zhou Q，Liang QQ，et al.IGF-1 regulation of type II collagen and MMP-13 expression in rat endplate chondrocytes via distinct signaling pathways[J].Osteoarthritis Cartilage， 2009；17（1）：100-106.
[10]魏立，江莉婷，周琦，等.大鼠髁突软骨细胞凋亡与胰岛素样生长因子1的影响[J].中国组织工程研究，2013，17（33）： 5901-5908.
[11]肖飞，陈聚伍，王福建，等.胰岛素样生长因子-1在家兔骨折愈合过程中的作用[J].中华实验外科杂志，2013，30（9）：1936-1938.
[12]Barbero A，Grogan S，Schfer D，et al.Age related changes in human articular chondrocyte yield，proliferation and post-expansion chondrogenic capacity[J].Osteoarthritis Cartilage，2004，12（6）：476-484.
[13]赵广，荆吉峰，张治宇，等.胰岛素样生长因子1促进创伤性关节炎软骨细胞的体外增殖[J].中国组织工程研究，2014，18（2）：183-186.
[收稿日期]2015-03-05 [修回日期]2015-05-13
编辑/张惠娟