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摘要[目的] 构建含 GFPLC3B 基因的真核表达载体。[方法] 从 HEK293 细胞中提取总 RNA，以反转录得到 cDNA 为模板，根据 Gen Bank 公布的人源 LC3B 基因序列设计引物，通过 PCR 方式扩增目的基因，将基因和 pcDNA3.1GFP 载体双酶切后，通过 T4 连接酶将基因连接到 pcDNA3.1GFP 载体上，得到 pcDNA3.1GFPLC3B真核表达载体。[结果] 扩增出目的基因，构建了含目的基因的真核表达载体 pcDNA3.1GFPLC3B。[结论] 成功构建了含有人 LC3B 基因的真核表达载体pcDNA3.1GFPLC3B，为研究细胞自噬提供了基础。
关键词HEK293 cells；LC3B；pcDNA3.1GFP；真核表达
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-082-03
为微管相关蛋白 1 轻链 3，是酵母 Atg8 的同源体[1]。 LC3 包括 LC3I和LC3II，前者是可溶性的，后者结合于自噬结构膜上。 Kabeya等[2]发现，LC3II 在自噬体和自噬前体的内外膜特异表达，且LC3II的表达与自噬结构的形成成正比，因此常用 GFPLC3 作为自噬体的标志物，观察活细胞的自噬活动[3]。哺乳动物自噬蛋白 LC3 常作为自噬体的标记，在4种 LC3 同源异构体中，LC3B 最常被用作标记物[4]，因此，笔者对含 GFPLC3B 基因的真核表达载体的构建进行了研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂。逆转录酶 mlV、质粒小提试剂盒、DNA 胶纯化试剂盒、随机引物（TaKaRa 公司），磷酸钙转染试剂盒（碧云天公司）。
1.1.2主要仪器。PE480 型 DNA 扩增仪 PCR 仪（PE 公司），凝胶图像分析仪（Vilberlourmat 公司），AB1310 全自动 DNA 测序仪（PerkinElmer 公司），Hera Cell 150 CO2 细胞培养箱（Heraeus 公司）。
1.1.3试验材料。HEK293 细胞、WRL68 细胞、宿主菌 DH 5α 均由南京师范大学江苏省分子医学实验室保存，pcDNA3.1GFP 载体质粒由南京医科大学馈赠。
1.2方法
1.2.1LC3B基因模板的获得。Trizol 法提取 HEK293 细胞内总 RNA，mRNA逆转录合成 cDNA， PCR 反应条件：各引物终浓度0.1 μmol/L，dNTP 各 50 μmol/L，Taq 酶 2 μl，MgCl2 115 mmol/L，合计50 μl。PCR扩增程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 变性 45 s，56 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸 1 min，30 个循环；最后 72 ℃ 延伸 10 min。PCR 产物放入 -20 ℃ 冰箱备用。
1.2.2 LC3B基因引物设计。使用 Primer软件，根据 Gen Bank 公布的人源 LC3B 基因序列设计引物，两端分别引入 BamH I 和EcoR I 酶切位点，并在 BamH I 酶切位点后加入 Kozak 序列。P1上游引物：5′CGC GGATCC GCCACC ATGCCGTCGGAGAAGACC3′ BamH I ；下游引物：5′CCG GAATTC TTACACTGACAATTTCAT3′ EcoR I。该引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1.2.3 LC3B基因的扩增和获得。 PCR反应体系（50 μl）：P1（20 μmol/L）1 μl，P2（20 μmol/L）1 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μl，10×PCR Buffer 5 μl，模板cDNA 1 μl，MgCl2（25 mmol/L）3 μl，Taq酶 0.25 μl，dd H2O 4.75 μl。PCR反应条件：95 ℃ 预变性 5 min；95 ℃ 变性 30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min；30 个循环，最后72 ℃延伸 7 min。对 PCR 产物进行 1.5% Agarose 电泳鉴定，紫外灯下观察拍照。
1.2.4 LC3B基因PCR产物纯化。回收目的基因，在紫外灯下切下目的条带，加入DRI Buffer，均匀混合后 75 ℃ 加热融化胶块 6～10 min，加入 1/2 DRI Buffer 体积的 DRII Buffer，均匀混合。将上清液转移至 Spin Column 中，12 000 r/min离心 1 min，弃滤液。加入 500 μl Rinse A，12 000 r/min离心 30 s，弃滤液。加入 700 μl Rinse B，12 000 r/min 离心 30 s，弃滤液，重复1次。将 Spin Column 安置于新的 15 ml EP 管中，加入 25 μl灭菌水（加热到 60 ℃），室温静置 1 min。 12 000 r/min 离心 1 min ，洗脱 DNA。纯化目的片段，进行 1.5% Agarose 电泳鉴定。
1.2.5基因与 T 载体连接并测序。按照 pMD19T 载体试剂盒说明进行。取 2 μl 纯化后的 DNA产物与 pMD19T 载体和双蒸水共 5 μl，加入等量 Solution I，16 ℃ 连接 1 h ，取连接混合物 10 μl 加入到 100 μl 感受态细胞液中，冰浴 30 min 后 42 ℃ 水浴热激 90 s，立即置冰上，冰浴 5 min；每管加入 800 μl 经 37 ℃ 预热的 LB 液体培养基，37 ℃ 220 r/min 振荡培养 1 h，12 000 r/min 离心 3 min，弃部分上清，留约 200 μl 菌液重悬后涂布于含 50 μg/ml Kan+ 的 LB 固体培养基平板上，37 ℃正置 1 h 后，倒置培养过夜。挑选白色克隆株进行菌落 PCR 鉴定，菌液送上海华大基因科技股份有限公司测序。 1.2.6质粒 pcDNA3.1GFP 的提取。质粒提取按照 Plasmid Miniprep Kit 操作指南进行。提取后-20 ℃ 冰箱保存备用。所得质粒进行 1.5% Agarose 电泳鉴定。
1.2.7目的基因与载体双酶切。LC3B 目的基因和提取的 pcDNA3.1GFP 质粒分别用限制性内切酶 BamH I 和 EcoR I 进行双酶切。酶切体系：dd H2O 6 μl，10 × Buffer 2 μl，样品 10 μl，BamH I 1 μl，共20 μl。酶切反应条件：37 ℃，7 h。酶切过后，每管加入 6 × Loading Buffer 5 μl 终止反应，后用1.5% Agarose 电泳分离酶切基因与载体，把酶切好的目的基因与载体用 DNA 凝胶回收试剂盒割胶回收。
1.2.8目的基因与载体连接。将酶切后的 LC3B 片段和质粒经割胶纯化后，用 T4 DNA 连接酶连接。连接反应体系为（10 μl）： dd H2O 3 μl，10 × T4 Ligase Buffer 1 μl，LC3B 基因3 μl，pcDNA3.1GFP 载体 2 μl，10 × T4 Ligase 1 μl。连接反应条件为： 16 ℃ 水浴，过夜连接 14～16 h。
1.2.9连接产物的转化。取 20 μl 连接产物与 200 μl 制备好的感受态细胞混合均匀，冰浴 40 min；42 ℃ 水浴热激 90 s，立即置冰上，冰浴 5 min；每管加入 800 μl 经 37 ℃预热的 LB 液体培养基，37 ℃、220 r/min 振荡培养 1 h，12 000 r/min 离心 3 min，弃部分上清，留约 200 μl 菌液重悬后涂布于 50 μg/ml Kan+ 的 LB 固体培养基平板上，37 ℃正置 1 h 后，倒置培养过夜。
1.2.10阳性克隆的筛选与鉴定。
1.2.10.1菌落 PCR 鉴定阳性克隆。随机挑取单克隆菌落至含 50 μg/ml Kan+ 的 3 ml LB 液中，37 ℃、220 r/min 振荡培养过夜。取 2 μl 菌落进行PCR 鉴定，PCR 体系与条件同“1.2.3”。PCR 产物用1.5% Agarose 电泳鉴定，紫外灯下观察拍照。
1.2.10.2双酶切鉴定阳性克隆。提取质粒，用 BamH I 和 EcoR I 进行双酶切鉴定，酶切体系与条件同“1.2.7”。酶切产物用1.5% Agarose 电泳鉴定，紫外灯下观察拍照。
1.2.11 DNA 测序。用 pcDNA3.1 质粒的通用引物进行基因测序，进一步确认质粒构建是否成功。
1.2.12重组质粒转染细胞检测自噬。按照磷酸钙转染试剂盒说明进行，将重组质粒转入HEK293 细胞中，在荧光显微镜下观察转染基因的表达。
2结果与分析
2.1目的基因扩增结果LC3B 基因是以从 HEK293 细胞中提取 RNA 经反转录得到的 cDNA 为模板，通过引物扩增出的，条带大小约为 378 bp（图1）。条带 1 PCR 扩增结果背景清晰，条带单一明亮，可基本确定所扩增片段为基因片段 LC3B。
注：M为DNA Marker；1为LC3B基因。
图1 LC3B 基因扩增结果2.2菌落扩增结果以菌落为模板，通过引物扩增出 LC3B 基因，大小约为 378 bp（图2）。条带 2、3 扩增结果背景清晰，条带单一明亮，可以基本确定该菌落为阳性克隆菌。
注：M为DNA Marker； 1和2为LC3B菌落扩增。
图2 目的菌落扩增结果2.3双酶切鉴定结果以酶切位点 BamH I 和 EcoR I 进行双酶切鉴定后（图3），pcDNA3.1GFPLC3B 双酶切后有2条带，上面的条带大小与条带 2 大小相似，且略小，下面的条带大小约为 378 bp，由此可推断LC3B 基因成功插入双酶切后的 pcDNA3.1GFP （约6 170 bp）载体中，即 pcDNA3.1GFPLC3B 重组质粒构建成功。
2.4 pcDNA3.1GFPLC3B载体测序结果 将构建成功的 pcDNA3.1GFPLC3B 菌液进行 DNA 测序，进一步鉴定质粒构建是否成功。测序结果显示，正反两向引物所扩增出的基因序列与从数据库提取的序列相同，所以确定 pcDNA3.1GFPLC3B 构建成功。
注：M为DNA Marker； 1为双酶切后的质粒和基因； 2为pcDNA3.1GFPLC3B重组质粒。
图3重组质粒双酶切鉴定2.5GFPLC3B质粒在HEK293细胞中的表达情况将 GFPLC3B 质粒经磷酸钙转染法转染至 HEK293细胞 24 h 后，在荧光显微镜下观察（图4），由于重组质粒带有GFP 基因，在细胞未发生自噬时，LC3B表现为 LC3BI， 均匀分布于细胞质中，故转染 GFPLC3B 质粒的 HEK293 细胞中很明显出现均匀的绿色荧光，证明重组质粒 GFPLC3B 转染成功。
2.6镉诱导HEK293细胞和WRL68细胞的自噬情况成功转染 GFPLC3B 质粒后的 HEK293 细胞和WRL68 细胞， 以10 μmol/L CdCl2 诱导处理 8 h 后，两细胞均出现了不同程度的绿色点状聚集现象，即未发生自噬时均匀分布于细胞中的 LC3BI（18 kDa）在 CdCl2 的诱导下向 LC3BII（16 kDa）转变，即GFPLC3BI向 GFPLC3BII 转化，而LC3BII 一般只出现在自噬体膜或溶酶体膜上，从而形成集中于自噬体膜或溶酶体膜上的绿色荧光点状聚集。Dong等[5] 发现低浓度镉离子（< 10 μmol/L）可以抑制因缺乏小牛血清与碱性成纤维细胞生长因子而引起的细胞自噬。此细胞试验再次证明 pcDNA3.1GFPLC3B 重组质粒构建成功。 注：A 为未经质粒转染的细胞，B为成功转染 GFPLC3B 质粒的细胞。
图4荧光显微镜下GFPLC3B 在 HEK293 细胞中的表达情况
图5荧光显微镜下镉诱导 HEK293 细胞和 WRL68 细胞的自噬情况3讨论
自噬基因 LC3B 有 I 型和 II 型之分。细胞未发生自噬时，细胞内合成的 LC3B 经过加工，成为胞浆可溶性的 I 型 LC3B，当自噬发生时，I 型 LC3B 经泛素样加工修饰过程，LC3I 与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，形成 II 型 LC3B。LC3BII 结合在胞内自噬体的膜上，LC3BII 含量的多少与自噬泡数量成正比[6-7]。因此 LC3B 的表达量与自噬程度密切相关。
该试验以 Gene Bank 公布的人源 LC3B 的 cDNA 序列为依据，在起始密码子AUG 及终止密码子处设计引物，并在5′端和 3′端分别引入 BamH I 和 EcoR I酶切位点， BamH I 和 EcoR I 在 LC3B 基因序列中不存在，但在pcDNA3.1GFP质粒的多克隆位点处存在，同时在目的基因的 5′端 ATG 前面引入 Kozak 序列 GCCACC 后，有助于提高基因的转录和翻译效率。
构建克隆载体时选择 T 载体，利用 TA 克隆，无需使用含限制酶序列的引物，无需优化 PCR 产物，不需做平端处理及添加接头即可直接进行基因克隆，操作方便，成功率高。Xu 等[8]、Lu等[9]在克隆、测序目的基因时都采用 TA 克隆。
该研究采用 pcDNA3.1GFP质粒，原因是GFP具有以下优点：①个GFP个基因片段长度较小（约717 bp），易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，可在多种异源生物中表达且无细胞毒性，蛋白本身性质稳定。在荧光显微镜下，用波长约 490 nm 的紫外光激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；在荧光显微镜下观察到绿色荧光，说明 GFPLC3B 融合蛋白在细胞内表达成功。②无需任何作用底物或共作用物，检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检测率[10]。
在荧光显微镜下观察到GFPLC3B 会弥散性分布在胞浆内，当细胞自噬时，GFPLC3BII表达在自噬体膜或溶酶体膜上使细胞呈现绿色荧光点状聚集，为细胞自噬提供依据。因此，pcDNA3.1GFPLC3B 重组质粒的成功构建为今后研究细胞自噬提供了一定基础。
安徽农业科学2015年参考文献
[1] OGATA M，HINO S，SAITO A，et al.Autophagy is activated for cell survival after endoplasmic reticulum stress[J].Mol Cell Biol，2006，26（24）：9220-9231.
[2] KABEYA Y，MIZUSHIMA N，UENO T，et al.LC3，a mammol/Lalian homologue of yeast Atg8，is localized in autophagosome membranes after processing[J].EMBO J，2000，19（21）：57200-57228.
[3] KOUNO T，MIZUGUCHI M，TANIDA I，et al.Solution structure of microtubule-associated protein light chain 3 and iden-tification of its functional subdomains[J].J Biol Chem，2005，280（26）：24610-24617.
[4] KLIONSKY DJ，ABELIOVICH H，AGOSTINIS P，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes[J].Autophagy，2008，4（2）：151-175.
关键词HEK293 cells；LC3B；pcDNA3.1GFP；真核表达
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-082-03
为微管相关蛋白 1 轻链 3，是酵母 Atg8 的同源体[1]。 LC3 包括 LC3I和LC3II，前者是可溶性的，后者结合于自噬结构膜上。 Kabeya等[2]发现，LC3II 在自噬体和自噬前体的内外膜特异表达，且LC3II的表达与自噬结构的形成成正比，因此常用 GFPLC3 作为自噬体的标志物，观察活细胞的自噬活动[3]。哺乳动物自噬蛋白 LC3 常作为自噬体的标记，在4种 LC3 同源异构体中，LC3B 最常被用作标记物[4]，因此，笔者对含 GFPLC3B 基因的真核表达载体的构建进行了研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂。逆转录酶 mlV、质粒小提试剂盒、DNA 胶纯化试剂盒、随机引物（TaKaRa 公司），磷酸钙转染试剂盒（碧云天公司）。
1.1.2主要仪器。PE480 型 DNA 扩增仪 PCR 仪（PE 公司），凝胶图像分析仪（Vilberlourmat 公司），AB1310 全自动 DNA 测序仪（PerkinElmer 公司），Hera Cell 150 CO2 细胞培养箱（Heraeus 公司）。
1.1.3试验材料。HEK293 细胞、WRL68 细胞、宿主菌 DH 5α 均由南京师范大学江苏省分子医学实验室保存，pcDNA3.1GFP 载体质粒由南京医科大学馈赠。
1.2方法
1.2.1LC3B基因模板的获得。Trizol 法提取 HEK293 细胞内总 RNA，mRNA逆转录合成 cDNA， PCR 反应条件：各引物终浓度0.1 μmol/L，dNTP 各 50 μmol/L，Taq 酶 2 μl，MgCl2 115 mmol/L，合计50 μl。PCR扩增程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 变性 45 s，56 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸 1 min，30 个循环；最后 72 ℃ 延伸 10 min。PCR 产物放入 -20 ℃ 冰箱备用。
1.2.2 LC3B基因引物设计。使用 Primer软件，根据 Gen Bank 公布的人源 LC3B 基因序列设计引物，两端分别引入 BamH I 和EcoR I 酶切位点，并在 BamH I 酶切位点后加入 Kozak 序列。P1上游引物：5′CGC GGATCC GCCACC ATGCCGTCGGAGAAGACC3′ BamH I ；下游引物：5′CCG GAATTC TTACACTGACAATTTCAT3′ EcoR I。该引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1.2.3 LC3B基因的扩增和获得。 PCR反应体系（50 μl）：P1（20 μmol/L）1 μl，P2（20 μmol/L）1 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μl，10×PCR Buffer 5 μl，模板cDNA 1 μl，MgCl2（25 mmol/L）3 μl，Taq酶 0.25 μl，dd H2O 4.75 μl。PCR反应条件：95 ℃ 预变性 5 min；95 ℃ 变性 30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min；30 个循环，最后72 ℃延伸 7 min。对 PCR 产物进行 1.5% Agarose 电泳鉴定，紫外灯下观察拍照。
1.2.4 LC3B基因PCR产物纯化。回收目的基因，在紫外灯下切下目的条带，加入DRI Buffer，均匀混合后 75 ℃ 加热融化胶块 6～10 min，加入 1/2 DRI Buffer 体积的 DRII Buffer，均匀混合。将上清液转移至 Spin Column 中，12 000 r/min离心 1 min，弃滤液。加入 500 μl Rinse A，12 000 r/min离心 30 s，弃滤液。加入 700 μl Rinse B，12 000 r/min 离心 30 s，弃滤液，重复1次。将 Spin Column 安置于新的 15 ml EP 管中，加入 25 μl灭菌水（加热到 60 ℃），室温静置 1 min。 12 000 r/min 离心 1 min ，洗脱 DNA。纯化目的片段，进行 1.5% Agarose 电泳鉴定。
1.2.5基因与 T 载体连接并测序。按照 pMD19T 载体试剂盒说明进行。取 2 μl 纯化后的 DNA产物与 pMD19T 载体和双蒸水共 5 μl，加入等量 Solution I，16 ℃ 连接 1 h ，取连接混合物 10 μl 加入到 100 μl 感受态细胞液中，冰浴 30 min 后 42 ℃ 水浴热激 90 s，立即置冰上，冰浴 5 min；每管加入 800 μl 经 37 ℃ 预热的 LB 液体培养基，37 ℃ 220 r/min 振荡培养 1 h，12 000 r/min 离心 3 min，弃部分上清，留约 200 μl 菌液重悬后涂布于含 50 μg/ml Kan+ 的 LB 固体培养基平板上，37 ℃正置 1 h 后，倒置培养过夜。挑选白色克隆株进行菌落 PCR 鉴定，菌液送上海华大基因科技股份有限公司测序。 1.2.6质粒 pcDNA3.1GFP 的提取。质粒提取按照 Plasmid Miniprep Kit 操作指南进行。提取后-20 ℃ 冰箱保存备用。所得质粒进行 1.5% Agarose 电泳鉴定。
1.2.7目的基因与载体双酶切。LC3B 目的基因和提取的 pcDNA3.1GFP 质粒分别用限制性内切酶 BamH I 和 EcoR I 进行双酶切。酶切体系：dd H2O 6 μl，10 × Buffer 2 μl，样品 10 μl，BamH I 1 μl，共20 μl。酶切反应条件：37 ℃，7 h。酶切过后，每管加入 6 × Loading Buffer 5 μl 终止反应，后用1.5% Agarose 电泳分离酶切基因与载体，把酶切好的目的基因与载体用 DNA 凝胶回收试剂盒割胶回收。
1.2.8目的基因与载体连接。将酶切后的 LC3B 片段和质粒经割胶纯化后，用 T4 DNA 连接酶连接。连接反应体系为（10 μl）： dd H2O 3 μl，10 × T4 Ligase Buffer 1 μl，LC3B 基因3 μl，pcDNA3.1GFP 载体 2 μl，10 × T4 Ligase 1 μl。连接反应条件为： 16 ℃ 水浴，过夜连接 14～16 h。
1.2.9连接产物的转化。取 20 μl 连接产物与 200 μl 制备好的感受态细胞混合均匀，冰浴 40 min；42 ℃ 水浴热激 90 s，立即置冰上，冰浴 5 min；每管加入 800 μl 经 37 ℃预热的 LB 液体培养基，37 ℃、220 r/min 振荡培养 1 h，12 000 r/min 离心 3 min，弃部分上清，留约 200 μl 菌液重悬后涂布于 50 μg/ml Kan+ 的 LB 固体培养基平板上，37 ℃正置 1 h 后，倒置培养过夜。
1.2.10阳性克隆的筛选与鉴定。
1.2.10.1菌落 PCR 鉴定阳性克隆。随机挑取单克隆菌落至含 50 μg/ml Kan+ 的 3 ml LB 液中，37 ℃、220 r/min 振荡培养过夜。取 2 μl 菌落进行PCR 鉴定，PCR 体系与条件同“1.2.3”。PCR 产物用1.5% Agarose 电泳鉴定，紫外灯下观察拍照。
1.2.10.2双酶切鉴定阳性克隆。提取质粒，用 BamH I 和 EcoR I 进行双酶切鉴定，酶切体系与条件同“1.2.7”。酶切产物用1.5% Agarose 电泳鉴定，紫外灯下观察拍照。
1.2.11 DNA 测序。用 pcDNA3.1 质粒的通用引物进行基因测序，进一步确认质粒构建是否成功。
1.2.12重组质粒转染细胞检测自噬。按照磷酸钙转染试剂盒说明进行，将重组质粒转入HEK293 细胞中，在荧光显微镜下观察转染基因的表达。
2结果与分析
2.1目的基因扩增结果LC3B 基因是以从 HEK293 细胞中提取 RNA 经反转录得到的 cDNA 为模板，通过引物扩增出的，条带大小约为 378 bp（图1）。条带 1 PCR 扩增结果背景清晰，条带单一明亮，可基本确定所扩增片段为基因片段 LC3B。
注：M为DNA Marker；1为LC3B基因。
图1 LC3B 基因扩增结果2.2菌落扩增结果以菌落为模板，通过引物扩增出 LC3B 基因，大小约为 378 bp（图2）。条带 2、3 扩增结果背景清晰，条带单一明亮，可以基本确定该菌落为阳性克隆菌。
注：M为DNA Marker； 1和2为LC3B菌落扩增。
图2 目的菌落扩增结果2.3双酶切鉴定结果以酶切位点 BamH I 和 EcoR I 进行双酶切鉴定后（图3），pcDNA3.1GFPLC3B 双酶切后有2条带，上面的条带大小与条带 2 大小相似，且略小，下面的条带大小约为 378 bp，由此可推断LC3B 基因成功插入双酶切后的 pcDNA3.1GFP （约6 170 bp）载体中，即 pcDNA3.1GFPLC3B 重组质粒构建成功。
2.4 pcDNA3.1GFPLC3B载体测序结果 将构建成功的 pcDNA3.1GFPLC3B 菌液进行 DNA 测序，进一步鉴定质粒构建是否成功。测序结果显示，正反两向引物所扩增出的基因序列与从数据库提取的序列相同，所以确定 pcDNA3.1GFPLC3B 构建成功。
注：M为DNA Marker； 1为双酶切后的质粒和基因； 2为pcDNA3.1GFPLC3B重组质粒。
图3重组质粒双酶切鉴定2.5GFPLC3B质粒在HEK293细胞中的表达情况将 GFPLC3B 质粒经磷酸钙转染法转染至 HEK293细胞 24 h 后，在荧光显微镜下观察（图4），由于重组质粒带有GFP 基因，在细胞未发生自噬时，LC3B表现为 LC3BI， 均匀分布于细胞质中，故转染 GFPLC3B 质粒的 HEK293 细胞中很明显出现均匀的绿色荧光，证明重组质粒 GFPLC3B 转染成功。
2.6镉诱导HEK293细胞和WRL68细胞的自噬情况成功转染 GFPLC3B 质粒后的 HEK293 细胞和WRL68 细胞， 以10 μmol/L CdCl2 诱导处理 8 h 后，两细胞均出现了不同程度的绿色点状聚集现象，即未发生自噬时均匀分布于细胞中的 LC3BI（18 kDa）在 CdCl2 的诱导下向 LC3BII（16 kDa）转变，即GFPLC3BI向 GFPLC3BII 转化，而LC3BII 一般只出现在自噬体膜或溶酶体膜上，从而形成集中于自噬体膜或溶酶体膜上的绿色荧光点状聚集。Dong等[5] 发现低浓度镉离子（< 10 μmol/L）可以抑制因缺乏小牛血清与碱性成纤维细胞生长因子而引起的细胞自噬。此细胞试验再次证明 pcDNA3.1GFPLC3B 重组质粒构建成功。 注：A 为未经质粒转染的细胞，B为成功转染 GFPLC3B 质粒的细胞。
图4荧光显微镜下GFPLC3B 在 HEK293 细胞中的表达情况
图5荧光显微镜下镉诱导 HEK293 细胞和 WRL68 细胞的自噬情况3讨论
自噬基因 LC3B 有 I 型和 II 型之分。细胞未发生自噬时，细胞内合成的 LC3B 经过加工，成为胞浆可溶性的 I 型 LC3B，当自噬发生时，I 型 LC3B 经泛素样加工修饰过程，LC3I 与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，形成 II 型 LC3B。LC3BII 结合在胞内自噬体的膜上，LC3BII 含量的多少与自噬泡数量成正比[6-7]。因此 LC3B 的表达量与自噬程度密切相关。
该试验以 Gene Bank 公布的人源 LC3B 的 cDNA 序列为依据，在起始密码子AUG 及终止密码子处设计引物，并在5′端和 3′端分别引入 BamH I 和 EcoR I酶切位点， BamH I 和 EcoR I 在 LC3B 基因序列中不存在，但在pcDNA3.1GFP质粒的多克隆位点处存在，同时在目的基因的 5′端 ATG 前面引入 Kozak 序列 GCCACC 后，有助于提高基因的转录和翻译效率。
构建克隆载体时选择 T 载体，利用 TA 克隆，无需使用含限制酶序列的引物，无需优化 PCR 产物，不需做平端处理及添加接头即可直接进行基因克隆，操作方便，成功率高。Xu 等[8]、Lu等[9]在克隆、测序目的基因时都采用 TA 克隆。
该研究采用 pcDNA3.1GFP质粒，原因是GFP具有以下优点：①个GFP个基因片段长度较小（约717 bp），易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，可在多种异源生物中表达且无细胞毒性，蛋白本身性质稳定。在荧光显微镜下，用波长约 490 nm 的紫外光激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；在荧光显微镜下观察到绿色荧光，说明 GFPLC3B 融合蛋白在细胞内表达成功。②无需任何作用底物或共作用物，检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检测率[10]。
在荧光显微镜下观察到GFPLC3B 会弥散性分布在胞浆内，当细胞自噬时，GFPLC3BII表达在自噬体膜或溶酶体膜上使细胞呈现绿色荧光点状聚集，为细胞自噬提供依据。因此，pcDNA3.1GFPLC3B 重组质粒的成功构建为今后研究细胞自噬提供了一定基础。
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