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摘要[目的] 研究枳壳挥发油的β-环糊精包合工艺，并建立可靠的测定包合率的方法。[方法]挥发油包合采用研磨法，检测方法为高效液相色谱法，色谱柱为ACE-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm），以甲醇-水（75∶25）为流动相，检测波长210 nm，柱温25 ℃，流速1 ml/min。[结果]枳壳挥发油最佳包合工艺为10倍量β-环糊精，挥发油与无水乙醇1∶1混匀，研磨30 min，60 ℃烘干。[结论]包合工艺稳定，质量可控。HPLC法测定枳壳挥发油中柠檬烯含量、计算包合率的方法快速准确、可靠，可作为枳壳挥发油包合率的测定方法。
关键词枳壳挥发油；β-环糊精；包合；工艺优化
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-065-03
枳壳始载于《雷公炮炙论》，为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实。枳壳挥发油具有促进胃排空和加快肠蠕动，对CaCl2、Ach及磷酸组织胺引起的痉挛性收缩有明显的松弛作用，且能减少胃酸量及对抗大鼠幽门结扎性溃疡的形成。枳壳挥发油中主要成分是柠檬烯。临床上，柠檬烯具有抗肿瘤、治疗胆囊炎等作用。另外，挥发油中另一重要成分芳樟醇，具有防腐、抗菌、抗病毒和镇静等作用[1]。
将枳壳挥发油制备成β-环糊精包合物，多数学者测定挥发油包合率的方法基本均为水蒸气再蒸馏包合物法重回收挥发油计算包合率，且测定挥发油多用气相色谱法[2]，而该试验采用HPLC法测定挥发油中柠檬烯的含量，计算挥发油包合物，为枳壳挥发油包合率的测定提供高效、简便、精确的方法。
1材料与方法
1.1试验仪器 安捷伦高相液相色谱仪；岛津UV-2401PC紫外可见分光光度计；超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。
1.2试剂试药 枳壳购自石家庄市诚信中药材有限公司；色谱甲醇；分析甲醇（北京化工）；无水乙醇（北京化工）；柠檬烯标准品（上海源叶生物科技有限公司，纯度为98%，批号YF0225SA14）。
1.3试验方法
1.3.1 枳壳挥发油的提取。称取适量枳壳药材，粉碎成最粗粉，加4倍量水，连接挥发油提取装置，加热回流提取至挥发油不再增加时（约4 h），停止加热，放置0.5 h，收集挥发油，用无水硫酸钠脱水干燥，备用。
1.3.2 挥发油包合方法。采用研磨法包合挥发油，取一定量的β-环糊精，将挥发油用适量无水乙醇溶解，缓缓加入β-CD中，边加边研磨，再缓慢加入相当于β-环糊精3倍量的水研磨成糊状，持续研磨一定时间后，适当温度烘干，将干包合物研磨成细粉，即得[3]。
1.3.3 包合物中挥发油含量的测定。
1.3.3.1 高效液相色谱条件。色谱柱为ACE-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm），以甲醇-水（75∶25）为流动相，流速 1 ml/min，检测波长210 nm，柱温25 ℃[4-5]。
1.3.3.2 对照品溶液的制备。精密称取柠檬烯对照品0.076 0 g，置于50 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，摇匀，即1.489 6 mg/ml。精密移取上述溶液5 ml，置于50 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，摇匀，过滤，即得。
1.3.3.3 挥发油样品的制备。精密吸取挥发油0.5 ml，置于5 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，摇匀。精密吸取1 ml置50 ml容量瓶，甲醇定容，摇匀。精密吸取1 ml置10 ml容量瓶，甲醇定容，摇匀，即得。
1.3.3.4 供试品溶液的制备。取β-CD包合物0.1 g，精密称定，置于25 ml容量瓶，加入甲醇20 ml，超声处理30 min，取出，放置至室温，甲醇定容，摇匀，过滤，即得。
1.3.3.5 检测波长的确定。取“1.3.3.2”项下制备的对照品溶液，以甲醇为空白，采用紫外可见分光光度法在200～400 nm波长范围内进行波长扫描。
1.3.4 方法学考察。
1.3.4.1 线性关系考察。分别精密吸取0.149 0 mg/ml的对照品溶液2、6、10、14、18 μl，按“1.3.3.1”色谱条件进样。以峰面积Y为纵坐标、进样体积为横坐标，绘制柠檬烯对照品的标准曲线。
1.3.4.2 精密度试验。取0.149 0 mg/ml的对照品溶液，进行精密度试验，按“1.3.3.1”色谱条件操作，连续进样6次，测定峰面积并计算RSD值。
1.3.4.3 稳定性试验。取“1.3.3.4”项下制备的供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、15、20、25 h进样，通过测定峰面积，计算RSD值。
1.3.4.4 重现性试验。取同一批枳壳挥发油包合物6份，每份0.1 g，精密称定，按“1.3.3.4”项制备供试品溶液，按“1.3.3.1”色谱条件进样测定，通过测定峰面积，计算RSD值。
1.3.4.5 加样回收率试验。精密称取已知柠檬烯含量的枳壳挥发油包合物6份，分别精密加入2 ml的浓度为1.489 6 mg/ml的对照品溶液，加入甲醇18 ml，按“1.3.3.4”制备供试品溶液，按“1.3.3.1”色谱条件测定其含量，计算平均加样回收率和RSD值。
1.3.5 正交试验。通过查阅文献，挥发油包合的常用方法有饱合水溶液法[6]、研磨法[7]、超声法[8]3种，试验采用研磨法考察包合工艺。选择β-CD用量、油：乙醇、研磨时间、烘干温度4个因素为影响枳壳挥发油研磨法包合的主要因素，每个因素设定3个水平，进行L9（34）正交试验（表1）。
2.1枳壳挥发油的提取 按“1.3.1”方法操作，得到的枳壳挥发油为淡黄色，香气浓郁，提取率约为2.0%。 2.2检测波长的确定 由图1可知，柠檬烯在210 nm波长处有最大吸收，故选择210 nm作为检测波长。
图1 柠檬烯紫外光扫描吸收光谱图2.3方法学考察
2.3.1 线性关系考察。由图2可见，柠檬烯对照品的线性回归方程为Y=151.45X-14.125（R2=0.999 9），表明当柠檬烯进样体积在2～18 μl范围内峰面积与进样量呈线性关系，即浓度在0.029 8～0.268 2 mg/ml范围内峰面积与质量浓度线性关系良好。
图2 柠檬烯对照品线性关系曲线2.3.2 精密度试验。按照“1.3.4.2”操作，经过计算得峰面积RSD值为0.99%，表明试验精密度良好。
2.3.3 稳定性试验。按照“1.3.4.3”操作，通过计算得供试品溶液柠檬烯峰在25 h内峰面积RSD值为1.11%，表明供试品溶液在25 h内时稳定的。
2.3.4 重现性试验。按照“1.3.4.4”操作，通过计算得柠檬烯峰面积RSD为0.76%，表明该供试品处理过程和分析方法均具有很好的重现性。
2.3.5 加样回收率。从表2可以看出，平均加样回收率为100.423 5%，RSD值为1.37%，表明该方法准确、可靠，可用于枳壳挥发油β-环糊精包合物的含量测定。
表2 加样回收率试验结果
2.4 正交试验由表3直观分析结果显示A2B1C2D3为最佳工艺，由方差分析（表4）得出各因素对包合率的影响程度为A>D>B>C，其中β-糊精用量（A）对试验结果有显著性影响。结合各因素水平对试验结果影响的效应曲线（图3），确定枳壳挥发油环糊精包合的最佳工艺为A3B1C2D3，即挥发油与环糊精的用量比为1∶10、挥发油与无水乙醇比例为1∶1、研磨时间为30 min、烘干温度为60 ℃。
2.5包合工艺的验证性试验 由于确定的最佳提取方案，在正交设计表中未出现，需进行工艺验证性试验。按最佳包合工艺，取挥发油2份，进行工艺验证，工艺验证结果（表5）经计算RSD值为0.15%，证明此包合方法结果稳定可靠，可用于制备枳壳挥发油包合物，其高效液相谱图如图4所示。
图4 柠檬烯对照品（a）、枳壳挥发油（b）、供试品（c）色谱图3 结论与讨论
试验结果表明，枳壳挥发油最佳包合工艺为10倍量β-环糊精，挥发油与无水乙醇1∶1混匀，研磨30 min，60 ℃烘干。该试验建立了高相液相色谱法测定枳壳挥发油β-环糊精包合物中柠檬烯含量的方法，从而计算包合率的方法，并对该方法进行了方法学验证。证明此方法简单快速，且精密度高、回收率好，所得结果准确可靠，可用于枳壳挥发油β-环糊精包合物中柠檬烯含量的测定。而且经过稳定性试验证明，挥发油在25 h内稳定，再次证明了枳壳挥发油采用高效液相色谱法测定的可行性。因此，该方法可以代替水蒸气再蒸馏枳壳挥发油β-环糊精包合物计算包合率的方法，为挥发油环糊精包合率测定提供更为准确，可靠的检测方法。
参考文献
[1] 舒尊鹏，胡书法，翟亚东，等.中药枳壳化学成分及药理作用研究[J].科技创新与应用，2012（7）：8-9.
[2] 潘馨.气相色谱法测定绿衣枳壳中柠檬烯的含量[J].海峡药学， 2004， 16（5）： 68-69.
[3] 师白梅，严建业，王元清，等.当归、枳壳挥发油的提取与包合工艺研究[J].中南药学，2012，10（6）：401-405.
[4] 张瑞伦，张庆，徐世艾.HPLC 法测定留兰香油中柠檬烯[J].安徽农业科学，2012，40（2）：743-744.
[5] 滕建业.枳壳促进胃动力化学物质组的筛选及作用机理研究[D].沈阳：辽宁中医药大学，2011.
[6] 杨小催，柯雪红，陈锦富，等.石菖蒲挥发油包合工艺及包合物稳定性研究[J].中药新药与临床药理，2010，21（2）：202-205.
[7] 张贻昌，黄桂福，笪贤伟，等.参附益心颗粒挥发油包合物的制备[J].中药材， 2010，33（12）：1956-1957.
[8] 林三清，陈智蕊，杨红艳，等.广藿香挥发油包合物制备方法的比较研究[J].中成药，2009，31（12）：1944.
关键词枳壳挥发油；β-环糊精；包合；工艺优化
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-065-03
枳壳始载于《雷公炮炙论》，为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实。枳壳挥发油具有促进胃排空和加快肠蠕动，对CaCl2、Ach及磷酸组织胺引起的痉挛性收缩有明显的松弛作用，且能减少胃酸量及对抗大鼠幽门结扎性溃疡的形成。枳壳挥发油中主要成分是柠檬烯。临床上，柠檬烯具有抗肿瘤、治疗胆囊炎等作用。另外，挥发油中另一重要成分芳樟醇，具有防腐、抗菌、抗病毒和镇静等作用[1]。
将枳壳挥发油制备成β-环糊精包合物，多数学者测定挥发油包合率的方法基本均为水蒸气再蒸馏包合物法重回收挥发油计算包合率，且测定挥发油多用气相色谱法[2]，而该试验采用HPLC法测定挥发油中柠檬烯的含量，计算挥发油包合物，为枳壳挥发油包合率的测定提供高效、简便、精确的方法。
1材料与方法
1.1试验仪器 安捷伦高相液相色谱仪；岛津UV-2401PC紫外可见分光光度计；超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。
1.2试剂试药 枳壳购自石家庄市诚信中药材有限公司；色谱甲醇；分析甲醇（北京化工）；无水乙醇（北京化工）；柠檬烯标准品（上海源叶生物科技有限公司，纯度为98%，批号YF0225SA14）。
1.3试验方法
1.3.1 枳壳挥发油的提取。称取适量枳壳药材，粉碎成最粗粉，加4倍量水，连接挥发油提取装置，加热回流提取至挥发油不再增加时（约4 h），停止加热，放置0.5 h，收集挥发油，用无水硫酸钠脱水干燥，备用。
1.3.2 挥发油包合方法。采用研磨法包合挥发油，取一定量的β-环糊精，将挥发油用适量无水乙醇溶解，缓缓加入β-CD中，边加边研磨，再缓慢加入相当于β-环糊精3倍量的水研磨成糊状，持续研磨一定时间后，适当温度烘干，将干包合物研磨成细粉，即得[3]。
1.3.3 包合物中挥发油含量的测定。
1.3.3.1 高效液相色谱条件。色谱柱为ACE-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm），以甲醇-水（75∶25）为流动相，流速 1 ml/min，检测波长210 nm，柱温25 ℃[4-5]。
1.3.3.2 对照品溶液的制备。精密称取柠檬烯对照品0.076 0 g，置于50 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，摇匀，即1.489 6 mg/ml。精密移取上述溶液5 ml，置于50 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，摇匀，过滤，即得。
1.3.3.3 挥发油样品的制备。精密吸取挥发油0.5 ml，置于5 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，摇匀。精密吸取1 ml置50 ml容量瓶，甲醇定容，摇匀。精密吸取1 ml置10 ml容量瓶，甲醇定容，摇匀，即得。
1.3.3.4 供试品溶液的制备。取β-CD包合物0.1 g，精密称定，置于25 ml容量瓶，加入甲醇20 ml，超声处理30 min，取出，放置至室温，甲醇定容，摇匀，过滤，即得。
1.3.3.5 检测波长的确定。取“1.3.3.2”项下制备的对照品溶液，以甲醇为空白，采用紫外可见分光光度法在200～400 nm波长范围内进行波长扫描。
1.3.4 方法学考察。
1.3.4.1 线性关系考察。分别精密吸取0.149 0 mg/ml的对照品溶液2、6、10、14、18 μl，按“1.3.3.1”色谱条件进样。以峰面积Y为纵坐标、进样体积为横坐标，绘制柠檬烯对照品的标准曲线。
1.3.4.2 精密度试验。取0.149 0 mg/ml的对照品溶液，进行精密度试验，按“1.3.3.1”色谱条件操作，连续进样6次，测定峰面积并计算RSD值。
1.3.4.3 稳定性试验。取“1.3.3.4”项下制备的供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、15、20、25 h进样，通过测定峰面积，计算RSD值。
1.3.4.4 重现性试验。取同一批枳壳挥发油包合物6份，每份0.1 g，精密称定，按“1.3.3.4”项制备供试品溶液，按“1.3.3.1”色谱条件进样测定，通过测定峰面积，计算RSD值。
1.3.4.5 加样回收率试验。精密称取已知柠檬烯含量的枳壳挥发油包合物6份，分别精密加入2 ml的浓度为1.489 6 mg/ml的对照品溶液，加入甲醇18 ml，按“1.3.3.4”制备供试品溶液，按“1.3.3.1”色谱条件测定其含量，计算平均加样回收率和RSD值。
1.3.5 正交试验。通过查阅文献，挥发油包合的常用方法有饱合水溶液法[6]、研磨法[7]、超声法[8]3种，试验采用研磨法考察包合工艺。选择β-CD用量、油：乙醇、研磨时间、烘干温度4个因素为影响枳壳挥发油研磨法包合的主要因素，每个因素设定3个水平，进行L9（34）正交试验（表1）。
2.1枳壳挥发油的提取 按“1.3.1”方法操作，得到的枳壳挥发油为淡黄色，香气浓郁，提取率约为2.0%。 2.2检测波长的确定 由图1可知，柠檬烯在210 nm波长处有最大吸收，故选择210 nm作为检测波长。
图1 柠檬烯紫外光扫描吸收光谱图2.3方法学考察
2.3.1 线性关系考察。由图2可见，柠檬烯对照品的线性回归方程为Y=151.45X-14.125（R2=0.999 9），表明当柠檬烯进样体积在2～18 μl范围内峰面积与进样量呈线性关系，即浓度在0.029 8～0.268 2 mg/ml范围内峰面积与质量浓度线性关系良好。
图2 柠檬烯对照品线性关系曲线2.3.2 精密度试验。按照“1.3.4.2”操作，经过计算得峰面积RSD值为0.99%，表明试验精密度良好。
2.3.3 稳定性试验。按照“1.3.4.3”操作，通过计算得供试品溶液柠檬烯峰在25 h内峰面积RSD值为1.11%，表明供试品溶液在25 h内时稳定的。
2.3.4 重现性试验。按照“1.3.4.4”操作，通过计算得柠檬烯峰面积RSD为0.76%，表明该供试品处理过程和分析方法均具有很好的重现性。
2.3.5 加样回收率。从表2可以看出，平均加样回收率为100.423 5%，RSD值为1.37%，表明该方法准确、可靠，可用于枳壳挥发油β-环糊精包合物的含量测定。
表2 加样回收率试验结果
2.4 正交试验由表3直观分析结果显示A2B1C2D3为最佳工艺，由方差分析（表4）得出各因素对包合率的影响程度为A>D>B>C，其中β-糊精用量（A）对试验结果有显著性影响。结合各因素水平对试验结果影响的效应曲线（图3），确定枳壳挥发油环糊精包合的最佳工艺为A3B1C2D3，即挥发油与环糊精的用量比为1∶10、挥发油与无水乙醇比例为1∶1、研磨时间为30 min、烘干温度为60 ℃。
2.5包合工艺的验证性试验 由于确定的最佳提取方案，在正交设计表中未出现，需进行工艺验证性试验。按最佳包合工艺，取挥发油2份，进行工艺验证，工艺验证结果（表5）经计算RSD值为0.15%，证明此包合方法结果稳定可靠，可用于制备枳壳挥发油包合物，其高效液相谱图如图4所示。
图4 柠檬烯对照品（a）、枳壳挥发油（b）、供试品（c）色谱图3 结论与讨论
试验结果表明，枳壳挥发油最佳包合工艺为10倍量β-环糊精，挥发油与无水乙醇1∶1混匀，研磨30 min，60 ℃烘干。该试验建立了高相液相色谱法测定枳壳挥发油β-环糊精包合物中柠檬烯含量的方法，从而计算包合率的方法，并对该方法进行了方法学验证。证明此方法简单快速，且精密度高、回收率好，所得结果准确可靠，可用于枳壳挥发油β-环糊精包合物中柠檬烯含量的测定。而且经过稳定性试验证明，挥发油在25 h内稳定，再次证明了枳壳挥发油采用高效液相色谱法测定的可行性。因此，该方法可以代替水蒸气再蒸馏枳壳挥发油β-环糊精包合物计算包合率的方法，为挥发油环糊精包合率测定提供更为准确，可靠的检测方法。
参考文献
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[5] 滕建业.枳壳促进胃动力化学物质组的筛选及作用机理研究[D].沈阳：辽宁中医药大学，2011.
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[8] 林三清，陈智蕊，杨红艳，等.广藿香挥发油包合物制备方法的比较研究[J].中成药，2009，31（12）：1944.