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摘要 通过向重茬地黄土壤（连作一茬和二茬）中添加不同比例过磷酸钙来调节土壤中的酚酸和微生物，改善连作土壤环境。结果表明，一个生长周期（6个月）后，一茬土壤中香草酸、香草醛和阿魏酸的含量均有所降低，而放线菌的量及真菌与细菌数量比却有所升高；二茬土壤中酚酸的量没有明显变化，但放线菌的量及真菌与细菌数量比均明显降低。因此，在连作一茬土壤中添加过磷酸钙可有效改善酚酸的量，二茬土壤相同处理则可以明显改善土壤微生态环境。
关键词 地黄；连作障碍；土壤；过磷酸钙；酚酸；微生物
中图分类号 S567.234 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）23-0241-02
Abstract In this paper，different proportions of calcium superphosphate were used to regulate the phenolic acid and microbes to improve the environment of the continuous cropping soil of Rehmannia glutinosa. The results showed that the content of vanillic acid，vanillin and ferulic acid reduced in the one stubble soil after 6 months，a growth cycle. But the actinomyces amount and the ratio of fungi and bacteria increased. The change of content of phenolic acid in two stubble soil was not obvious. But the actinomyces amount and the ratio of fungi and bacteria decreased obviously. Therefore，the addition of calcium superphosphate in one stubble soil could effectively ameliorate the amount of phenolic acidand and could aslo improve the environment of microbes in the two stubble soil.
Key words Rehmannia glutinosa；continuous cropping obstacle；soil；calcium superphosphate；phenolic acid；microbes
地黄为玄参科药用草本植物，广泛种植于河南、山西、山东、安徽、吉林等地。地黄的药用价值早在我国最早的药学专著《神农本草经》中就有记述，现代研究认为地黄具有降血糖、保肝、止血、利尿、抗炎、抗真菌等作用，其块根及其加工品分别作为鲜地黄、生地黄和熟地黄入药，属大宗常用中药材[1]。地黄忌连作，这已是几百年来公认的事实。由于需求量较大，适宜种植区域又有限，缓解地黄连作障碍已成为国内外的热点问题。
根际微生态失调可能是引起地黄连作障碍的重要因素，这点得到了很多研究者的认同[2-4]。目前，国内很多地黄主产区普遍缺磷，土壤偏碱，铁元素等溶解性差，进一步加重了根际微生态失衡。因此，改善土壤磷缺乏现状或稳定土壤微生物生态环境，可能是缓解地黄连作障碍的有效措施，但这方面的报道十分有限。因此，本文拟通过在重茬（连作1年和2年）土壤中添加过磷酸钙来调节连作土壤中的酚酸和微生物，改善连作土壤环境。
1 材料与方法
1.1 试验概况
试验在南开大学温室内进行，试验周期为2012年10月17日至2013年4月28日。试验所用地黄种植土壤采自山西省运城市，包括正茬土、一茬土和二茬土，土壤类型为半砂壤土。
1.2 试验设计
采用双因素随机区组处理，第1个因素为土壤，包括正茬、连作一茬、连作二茬3种土壤；第2个因素为过磷酸钙，包括低添加量和高添加量，分别为0.16%、0.32%（与土壤重量相比）。将不同比例的过磷酸钙分别与一茬、二茬土壤均匀混合，即一茬土壤添加0.16%过磷酸钙（A1）；一茬土壤添加0.32%过磷酸钙（B1）；一茬土壤不添加外源物质（CK1）；二茬土壤添加0.16%过磷酸钙（A2）；二茬土壤添加0.32%过磷酸钙（B2）；二茬土壤不添加外源物质（CK2）；正茬土壤不作任何处理（CK）。
1.3 试验方法
1.3.1 土壤处理。将拌好的土壤倒入规格为18 cm×19 cm的花盆中，每个花盆底部垫上剪好的纱布袋，以防漏土，每盆土壤（含外源添加物）总重为2.535 kg。定期给土壤浇水，使其保持适当的湿度。
1.3.2 酚酸含量测定。土壤酚酸的含量采用高效液相色谱法进行测定[5-6]。
（1）土壤提取液的制备。称取20 g土壤放入50 mL离心管中，加入20 mL 1 mol/L NaOH，超声波振荡30 min后静置过夜，次日再振荡30 min，3 000 r/min离心20 min，取上清液，12 mol/L浓盐酸滴定pH值为2.5，静置2 h后离心除去胡敏酸，用相同体积正丁醇萃取上清液3次后用旋转蒸发仪蒸干，再用甲醇溶解定容至2 mL，过0.45 μm膜待用，结果按照烘干土质量换算[5-6]。
（2）仪器。岛津LC-20AT高效液相色谱仪、配备LC-20AT输液泵、SPD-M20A紫外检测器、20 μL手动进样器定量环。超纯水器采用优普UPH-I-20L，旋转蒸发仪和数控超声仪分别为EYEL4OSB-2000、KH5200DB。 （3）色谱条件。色谱柱为Venusll XBP-C18（5 μm，100 A，4.6 mm×250.0 mm），流动相为0.01 mol/L NaAc∶HAc∶正丁醇∶氨水=100.00∶0.15∶2.00∶0.05，流速0.7 mL/min，进样量5 μL，检测波长277 nm。
（4）标准品和试剂。阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草酸标准品购自北京世纪奥科公司，香草醛标准品购自西亚试剂公司。流动相的甲醇、萃取所用正丁醇均为色谱醇，冰醋酸为国产分析纯，所有流动相和样品均用0.45 μm微孔滤膜过滤后使用。
1.3.3 微生物测定。土壤微生物量测定采用稀释涂布平板法，其中细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基混菌法，真菌采用马丁氏（Martin）培养基混菌法，放线菌采用改良高氏1号培养基混菌法，计数及鉴定按常规方法进行[5]。
2 结果与分析
2.1 土壤中酚酸类物质的含量
2.1.1 酚酸类物质的色谱检测。酚酸混合标准品色谱图见图1，酚酸样品色谱图见图2。由图2可以看出，当前试验条件可以将4种酚酸类物质较好地分离，因此确定采用此条件测定土壤中的对羟基苯甲酸、香草酸、香草醛和阿魏酸含量。
2.1.2 不同处理下酚酸类物质的含量。不同处理下土壤中酚酸类物质的含量见表1。可以看出，在重茬地黄土壤中添加过磷酸钙6个月后，4种酚酸类物质的含量依然高于正茬土壤。一茬土壤中加入高水平过磷酸钙（B1）可以大幅降低香草醛的含量，加入低水平过磷酸钙（A1）可以在一定程度上降低香草酸和阿魏酸的量。二茬土壤中添加过磷酸钙对降低4种酚酸效果不明显。
2.2 土壤中微生物含量的变化
一茬土壤中微生物量的变化情况见图3，二茬土壤中微生物量的变化情况见图4，一茬土壤中真菌与细菌数量的比值变化情况见图5，二茬土壤中真菌与细菌数量的比值变化情况见图6。随着磷肥添加量的增加，在一茬土壤中，放线菌的数量不断增加，细菌先减少后增加，真菌总体上呈增加趋势；在二茬土壤中，放线菌和真菌数量均呈减少的趋势，而细菌数量变化不明显。真菌与细菌数量的比值在一茬土壤中随磷肥添加量的增加先增加后减少，总体上呈增加趋势；而二茬土壤中则呈减少的趋势。
3 结论与讨论
从研究结果可知，在连作一茬地黄土壤中加入过磷酸钙6个月后降低了香草酸、香草醛和阿魏酸的含量，在二茬土壤中进行相同处理可以降低真菌与细菌的比值。
地黄是连作障碍最严重的植物之一，对于连作障碍的原因现有的研究报道主要集中在地黄根系分泌的化感物质以及土壤微生物生态环境两大方面[6]。杜家方[7]认为，影响地黄连作障碍的主要因素是其根系分泌的化感物质，主要为酚酸类化合物。在缺磷胁迫条件下，地黄根系能分泌低分子量的有机酸，这些有机酸可以活化土壤中的难溶磷，提高土
壤中有效磷的含量[8-10]。李振方等[11]的研究表明，地黄连作会使土壤由细菌型向真菌型转变，真菌数量的增多会使土壤肥力明显下降。在土壤中追施过磷酸钙可以提高土壤中有效磷的含量[12]，从而减缓因缺磷而引起的土壤微生态失衡，并在一定程度上减缓酚酸类物质对土壤理化性质的影响。但相同处理下，一茬土壤和二茬土壤在酚酸与微生物上的差异还有待进一步研究。
4 参考文献
[1] 温学森，杨世林，魏建和，等.地黄栽培历史及其品种考证[J].中草药，2002，33（10）：946-949.
[2] 陈慧，郝慧荣，熊君，等.地黄连作对根际微生物区系及土壤酶活性的影响[J].应用生态学报，2007，18（12）：2755-2759.
[3] 刘峰，温学森，刘彦飞，等.水苏糖对地黄根际土壤微生物失衡的影响[J].中草药学报，2007，38（12）：1871-1874.
[4] 张重义，陈慧，杨艳会，等.连作对地黄根际土壤细菌群落多样性的影响[J].应用生态学报，2010，21（11）：2843-2848.
[5] 何江华，付香斌，马东明，等.地黄块根膨大过程中土壤化感物质含量及微生物数量变化研究[J].河南科学，2008，26（11）：1369-1372.
[6] 张淑香，高子勤，刘海玲.连作障碍与根际微生态研究Ⅲ.土壤酚酸物质及其生物学效应[J].应用生态学报，2000，11（5）：741-744.
[7] 杜家方.地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）根区土壤中酚酸类物质的化感作用研究[D].郑州：河南农业大学，2009.
[8] 陆文龙，曹一平，张福锁.低分子量有机酸对土壤无机磷形态转化的影响[J].华北农学报1999，14（2）：1-5.
[9] GERKE J.Phosphate，aluminium and iron in the soil solution of three different soils in relation to varying concentrations of citric acid[J].Zeitschrift für Pflanzenern？覿hrung und Bodenkunde，1992，155（4）：339-343.
[10] JONES D L，DARRAH P R.Role of root derived organic acids in the mobilization of nutrients from the rhizosphere[J].Plant and Soil，1994，166（2）：247-257.
[11] 李振方，杨燕秋，谢冬凤，等.连作条件下地黄药用品质及土壤微生态特性分析[J].中国生态农业学报，2012，20（2）：217-224.
[12] 袁玲，杨邦俊，郑兰君，等.长期施肥对土壤酶活性和氮磷养分的影响[J].植物营养与肥料学报，1997，3（4）：300.
关键词 地黄；连作障碍；土壤；过磷酸钙；酚酸；微生物
中图分类号 S567.234 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）23-0241-02
Abstract In this paper，different proportions of calcium superphosphate were used to regulate the phenolic acid and microbes to improve the environment of the continuous cropping soil of Rehmannia glutinosa. The results showed that the content of vanillic acid，vanillin and ferulic acid reduced in the one stubble soil after 6 months，a growth cycle. But the actinomyces amount and the ratio of fungi and bacteria increased. The change of content of phenolic acid in two stubble soil was not obvious. But the actinomyces amount and the ratio of fungi and bacteria decreased obviously. Therefore，the addition of calcium superphosphate in one stubble soil could effectively ameliorate the amount of phenolic acidand and could aslo improve the environment of microbes in the two stubble soil.
Key words Rehmannia glutinosa；continuous cropping obstacle；soil；calcium superphosphate；phenolic acid；microbes
地黄为玄参科药用草本植物，广泛种植于河南、山西、山东、安徽、吉林等地。地黄的药用价值早在我国最早的药学专著《神农本草经》中就有记述，现代研究认为地黄具有降血糖、保肝、止血、利尿、抗炎、抗真菌等作用，其块根及其加工品分别作为鲜地黄、生地黄和熟地黄入药，属大宗常用中药材[1]。地黄忌连作，这已是几百年来公认的事实。由于需求量较大，适宜种植区域又有限，缓解地黄连作障碍已成为国内外的热点问题。
根际微生态失调可能是引起地黄连作障碍的重要因素，这点得到了很多研究者的认同[2-4]。目前，国内很多地黄主产区普遍缺磷，土壤偏碱，铁元素等溶解性差，进一步加重了根际微生态失衡。因此，改善土壤磷缺乏现状或稳定土壤微生物生态环境，可能是缓解地黄连作障碍的有效措施，但这方面的报道十分有限。因此，本文拟通过在重茬（连作1年和2年）土壤中添加过磷酸钙来调节连作土壤中的酚酸和微生物，改善连作土壤环境。
1 材料与方法
1.1 试验概况
试验在南开大学温室内进行，试验周期为2012年10月17日至2013年4月28日。试验所用地黄种植土壤采自山西省运城市，包括正茬土、一茬土和二茬土，土壤类型为半砂壤土。
1.2 试验设计
采用双因素随机区组处理，第1个因素为土壤，包括正茬、连作一茬、连作二茬3种土壤；第2个因素为过磷酸钙，包括低添加量和高添加量，分别为0.16%、0.32%（与土壤重量相比）。将不同比例的过磷酸钙分别与一茬、二茬土壤均匀混合，即一茬土壤添加0.16%过磷酸钙（A1）；一茬土壤添加0.32%过磷酸钙（B1）；一茬土壤不添加外源物质（CK1）；二茬土壤添加0.16%过磷酸钙（A2）；二茬土壤添加0.32%过磷酸钙（B2）；二茬土壤不添加外源物质（CK2）；正茬土壤不作任何处理（CK）。
1.3 试验方法
1.3.1 土壤处理。将拌好的土壤倒入规格为18 cm×19 cm的花盆中，每个花盆底部垫上剪好的纱布袋，以防漏土，每盆土壤（含外源添加物）总重为2.535 kg。定期给土壤浇水，使其保持适当的湿度。
1.3.2 酚酸含量测定。土壤酚酸的含量采用高效液相色谱法进行测定[5-6]。
（1）土壤提取液的制备。称取20 g土壤放入50 mL离心管中，加入20 mL 1 mol/L NaOH，超声波振荡30 min后静置过夜，次日再振荡30 min，3 000 r/min离心20 min，取上清液，12 mol/L浓盐酸滴定pH值为2.5，静置2 h后离心除去胡敏酸，用相同体积正丁醇萃取上清液3次后用旋转蒸发仪蒸干，再用甲醇溶解定容至2 mL，过0.45 μm膜待用，结果按照烘干土质量换算[5-6]。
（2）仪器。岛津LC-20AT高效液相色谱仪、配备LC-20AT输液泵、SPD-M20A紫外检测器、20 μL手动进样器定量环。超纯水器采用优普UPH-I-20L，旋转蒸发仪和数控超声仪分别为EYEL4OSB-2000、KH5200DB。 （3）色谱条件。色谱柱为Venusll XBP-C18（5 μm，100 A，4.6 mm×250.0 mm），流动相为0.01 mol/L NaAc∶HAc∶正丁醇∶氨水=100.00∶0.15∶2.00∶0.05，流速0.7 mL/min，进样量5 μL，检测波长277 nm。
（4）标准品和试剂。阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草酸标准品购自北京世纪奥科公司，香草醛标准品购自西亚试剂公司。流动相的甲醇、萃取所用正丁醇均为色谱醇，冰醋酸为国产分析纯，所有流动相和样品均用0.45 μm微孔滤膜过滤后使用。
1.3.3 微生物测定。土壤微生物量测定采用稀释涂布平板法，其中细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基混菌法，真菌采用马丁氏（Martin）培养基混菌法，放线菌采用改良高氏1号培养基混菌法，计数及鉴定按常规方法进行[5]。
2 结果与分析
2.1 土壤中酚酸类物质的含量
2.1.1 酚酸类物质的色谱检测。酚酸混合标准品色谱图见图1，酚酸样品色谱图见图2。由图2可以看出，当前试验条件可以将4种酚酸类物质较好地分离，因此确定采用此条件测定土壤中的对羟基苯甲酸、香草酸、香草醛和阿魏酸含量。
2.1.2 不同处理下酚酸类物质的含量。不同处理下土壤中酚酸类物质的含量见表1。可以看出，在重茬地黄土壤中添加过磷酸钙6个月后，4种酚酸类物质的含量依然高于正茬土壤。一茬土壤中加入高水平过磷酸钙（B1）可以大幅降低香草醛的含量，加入低水平过磷酸钙（A1）可以在一定程度上降低香草酸和阿魏酸的量。二茬土壤中添加过磷酸钙对降低4种酚酸效果不明显。
2.2 土壤中微生物含量的变化
一茬土壤中微生物量的变化情况见图3，二茬土壤中微生物量的变化情况见图4，一茬土壤中真菌与细菌数量的比值变化情况见图5，二茬土壤中真菌与细菌数量的比值变化情况见图6。随着磷肥添加量的增加，在一茬土壤中，放线菌的数量不断增加，细菌先减少后增加，真菌总体上呈增加趋势；在二茬土壤中，放线菌和真菌数量均呈减少的趋势，而细菌数量变化不明显。真菌与细菌数量的比值在一茬土壤中随磷肥添加量的增加先增加后减少，总体上呈增加趋势；而二茬土壤中则呈减少的趋势。
3 结论与讨论
从研究结果可知，在连作一茬地黄土壤中加入过磷酸钙6个月后降低了香草酸、香草醛和阿魏酸的含量，在二茬土壤中进行相同处理可以降低真菌与细菌的比值。
地黄是连作障碍最严重的植物之一，对于连作障碍的原因现有的研究报道主要集中在地黄根系分泌的化感物质以及土壤微生物生态环境两大方面[6]。杜家方[7]认为，影响地黄连作障碍的主要因素是其根系分泌的化感物质，主要为酚酸类化合物。在缺磷胁迫条件下，地黄根系能分泌低分子量的有机酸，这些有机酸可以活化土壤中的难溶磷，提高土
壤中有效磷的含量[8-10]。李振方等[11]的研究表明，地黄连作会使土壤由细菌型向真菌型转变，真菌数量的增多会使土壤肥力明显下降。在土壤中追施过磷酸钙可以提高土壤中有效磷的含量[12]，从而减缓因缺磷而引起的土壤微生态失衡，并在一定程度上减缓酚酸类物质对土壤理化性质的影响。但相同处理下，一茬土壤和二茬土壤在酚酸与微生物上的差异还有待进一步研究。
4 参考文献
[1] 温学森，杨世林，魏建和，等.地黄栽培历史及其品种考证[J].中草药，2002，33（10）：946-949.
[2] 陈慧，郝慧荣，熊君，等.地黄连作对根际微生物区系及土壤酶活性的影响[J].应用生态学报，2007，18（12）：2755-2759.
[3] 刘峰，温学森，刘彦飞，等.水苏糖对地黄根际土壤微生物失衡的影响[J].中草药学报，2007，38（12）：1871-1874.
[4] 张重义，陈慧，杨艳会，等.连作对地黄根际土壤细菌群落多样性的影响[J].应用生态学报，2010，21（11）：2843-2848.
[5] 何江华，付香斌，马东明，等.地黄块根膨大过程中土壤化感物质含量及微生物数量变化研究[J].河南科学，2008，26（11）：1369-1372.
[6] 张淑香，高子勤，刘海玲.连作障碍与根际微生态研究Ⅲ.土壤酚酸物质及其生物学效应[J].应用生态学报，2000，11（5）：741-744.
[7] 杜家方.地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）根区土壤中酚酸类物质的化感作用研究[D].郑州：河南农业大学，2009.
[8] 陆文龙，曹一平，张福锁.低分子量有机酸对土壤无机磷形态转化的影响[J].华北农学报1999，14（2）：1-5.
[9] GERKE J.Phosphate，aluminium and iron in the soil solution of three different soils in relation to varying concentrations of citric acid[J].Zeitschrift für Pflanzenern？覿hrung und Bodenkunde，1992，155（4）：339-343.
[10] JONES D L，DARRAH P R.Role of root derived organic acids in the mobilization of nutrients from the rhizosphere[J].Plant and Soil，1994，166（2）：247-257.
[11] 李振方，杨燕秋，谢冬凤，等.连作条件下地黄药用品质及土壤微生态特性分析[J].中国生态农业学报，2012，20（2）：217-224.
[12] 袁玲，杨邦俊，郑兰君，等.长期施肥对土壤酶活性和氮磷养分的影响[J].植物营养与肥料学报，1997，3（4）：300.