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摘要：目的观察回阳生肌膏及其拆方对糖尿病慢性皮肤溃疡大鼠白细胞介素-1α(IL-1α)和血栓素B2 (TXB2)含量的影响,探讨其促进糖尿病慢性皮肤溃疡愈合的作用机制。方法160只大鼠随机抽取6只作为空白组,不做任何处理,其余大鼠制备糖尿病模型,2周后随机分为1、3、5、7、14 d处理组,各处理组再分为正常组、模型组、回阳生肌膏组(全方组)、温阳益气拆方组(益气组)、活血生肌拆方组(活血组)。正常组及模型组给予凡士林纱条,全方组、益气组及活血组给予相应药物纱条。正常组采用皮肤缺损法,其他组采用复合因素制备慢性皮肤溃疡模型。在相应给药时间点处死各组大鼠,酶联免疫法检测各时点大鼠血清中IL-1α和TXB2的含量。结果IL-1α含量：给药3 d益气组显著高于空白组、模型组、全方组和活血组(P＜0.05)；给药5 d,全方组显著高于空白组和模型组(P＜0.05)；给药7 d,各给药组显著高于空白组和模型组(P＜0.05),全方组高于益气组、活血组(P＜0.05)；给药14 d,模型组和活血组低于空白组(P＜0.05)。TXB2含量：给药3 d,正常组和全方组高于空白组(P＜0.05)；给药5 d,全方组高于空白组和正常组(P＜0.05)；给药7 d,益气组高于空白组、模型组、全方组和活血组(P＜0.05)；给药14 d,活血组高于空白组、模型组、全方组和益气组(P＜0.05),空白组和正常组低于其他各给药组(P＜0.05)。结论回阳生肌膏及其拆方均能促进炎症反应,刺激炎症因子分泌,益气温阳药对创面的促炎作用早期更为明显。
关键词：回阳生肌膏；慢性皮肤溃疡；白细胞介素-1α；血栓素B2；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.07.013
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1005-5304(2014)07-0043-04
Influence of Huiyang Shengji Ointment and Its Modified Formulae on Serum Interleukin-1α and Thromboxane B2 in Diabetic Rats with Chronic Skin UlcersLI Yuan1,2, ZHAO Guang-ming2, DONG Jian-xun1, LU Guang-lin2, ZHANG Xu-hui2, XU Xu-ying1, WEI Ran-ran2, CHEN Bo2 (1.Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100010, China；2.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)
Abstract：Objective To observe the influence of Huiyang Shengji Ointment and its modified formulae on interleukin-1 (IL-1) and thromboxane B2 (TXB2) in diabetic rats with chronic skin ulcers, and explore the mechanism for promoting the healing of ulcer. Methods Six out of 160 rats were randomly selected as a blank group, without any further processing. The remaining rats were made diabetic model and randomly divided into five groups after 2 weeks：1 d, 3 d, 5 d, 7 d and 14 d groups. Then, these groups were further divided into normal group (Vaseline ointments), model group (Vaseline ointments), Huiyang Shengji Ointment group (whole formula Ointment), Wenyang Yiqi group (Yiqi group, modified Wenyang Yiqi formula ointments) and Huoxue Shengji group (Huoxue group, modified Huoxue Shengji formula ointments). Normal group and model group were given Vaseline ointments；whole formula group, Yiqi group and Huoxue group were given corresponding ointment. Normal group used the method of skin excision, while other groups used
基金项目：国家自然科学基金(81072808)；北京市教育委员会科技计划项目(KM201110025023)；
北京市高层次卫生技术人才学科带头人项目(2011-2-14)
通讯作者：路广林,E-mail：Lugl66@sina.com
STZ injection-hydrocortisone interference-skin excision-foreign body embedded preparation of composite factors for chronic skin ulcer model. After the appropriate treatment period, the rats were executed and tested for the contents of IL-1 and TXB2 in serum by enzyme-linked immunosorbent assay of five time points. Results In treatment 3 d, the contents of IL-1 in Yiqi group were significantly higher than the blank group, model group, whole formula group and Huoxue group (P＜0.05). In treatment 5 d, the contents of IL-1 in whole formula group were significantly higher than the blank group and model group (P＜0.05). In treatment 7 d, the contents of IL-1 in each treatment group were significantly higher than blank group and model group (P＜0.05), and the whole formula group was higher than the Yiqi group and Huoxue group. In treatment 14 d, the contents of IL-1 in model group and Huoxue group were lower than the blank group (P＜0.05). In treatment 3 d, the contents of TXB2 in normal group and the whole formula group were higher than the blank group (P＜0.05). In treatment 5 d, the contents of TXB2 in whole formula group were higher than the blank group and the normal group (P＜0.05). In treatment 7 d, the contents of TXB2 in Yiqi group were higher than the blank, the model, the whole formula and Huoxue groups (P＜0.05). In treatment 14 d, the contents of TXB2 in Huoxue group were higher than the blank and model group (P＜0.05), and the contents of TXB2 in the blank group and normal group was lower than those treatment groups (P＜0.05). Conclusion Huiyang Shengji Ointment and its modified formulae could promote inflammation, stimulate secretion of inflammatory cytokines, while Yiqi Wenyang ointments played a more active role in promoting inflammation of the early phase of wound surface.
Key words：Huiyang Shengji Ointment；chronic skin ulcer；IL-1；TXB2；rats
近年来,随着糖尿病的发病率增高,糖尿病慢性皮肤溃疡的发病率也逐年上升,病程迁延,治疗疗效差,对患者的生活质量造成了极大的影响。中医对慢性难愈性疾病的治疗有悠久的历史和丰富的经验,首都医科大学附属北京中医医院赵炳南、王玉章等已故名老中医创立的回阳生肌膏,对慢性皮肤溃疡的阴证疮疡有显著疗效。前期研究表明,回阳生肌膏中温阳益气类药物对慢性皮肤溃疡大鼠创面有促进炎症反应和愈合作用[1]。本实验观察回阳生肌膏及其拆方对糖尿病慢性皮肤溃疡大鼠不同时点血清中白细胞介素-1α(IL-1α)和血栓素B2(TXB2)含量的影响,以进一步完善“阳生阴长”理论,探讨其促进糖尿病慢性皮肤溃疡愈合的作用机制。
1实验材料
1.1动物
SD大鼠160只,雄性,体质量(220±20)g,SPF级。购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号：SCXK(京)2012-0001。饲养于SPF级动物房内,无菌手术在中国中医科学院中药研究所屏障动物实验设施内进行,温度20～22 ℃,相对湿度40%～60%,12 h光照、12 h避光循环饲养。
1.2药物
回阳生肌散、温阳益气拆方散、活血生肌拆方散、凡士林,均由首都医科大学附属北京中医医院制剂中心提供,批号20120516。回阳生肌散由肉桂、炮姜、人参、黄芪、川芎、芥子、白蔹组成；温阳益气拆方散由肉桂、炮姜、人参、黄芪、芥子组成；活血生肌拆方散由川芎、当归、白蔹组成。取回阳生肌散药粉、各拆方散药粉(各按药物比例取回阳生肌散中益气/活血等量药粉,余下量取对照粉末与拆方散药混匀,粉末总质量与回阳生肌散相等)与凡士林以1∶4比例混匀调成膏剂,均匀涂抹在纱布上制成药膏纱条。氢化可的松注射液(浓度5 g/L),购自天津金耀氨基酸有限公司。
1.3主要试剂与仪器
链脲佐菌素(STZ,货号：S0130)、柠檬酸、柠檬酸钠均购自上海前尘生物科技有限公司；血糖仪及其配套试纸均为罗氏公司产品(德国)。酶联免疫分析试剂盒、IL-1α试剂盒(批号Q03038392)、TXB2试剂盒(批号P15038388)均购自武汉华美生物工程有限公司。多功能酶标仪(Thermo公司)。
2实验方法
2.1分组与造模
将160只大鼠随机抽取6只作为空白组,不做任何处理。其余大鼠适应性喂养3 d后,实验前大鼠禁食不禁水12 h,称重。临用前配制0.1 mol/L、pH 4.2～4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及1%STZ溶液,冰浴放置。根据大鼠体质量,腹腔注射STZ 55 mg/kg；正常组注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。在注射STZ后72 h测量随机非空腹血糖,随机血糖＞16.7 mmol/L为糖尿病模型成模,未成模者每只补打20 mg/kg；全部成模2周后,根据大鼠体质量随机分为5个时间点,每时点30只,每时点再分5组,每组6只,分别为正常组、模型组,回阳生肌膏组(全方组)、温阳益气拆方组(益气组)、活血生肌拆方组(活血组)。分组后经大鼠股部肌肉注射氢化可的松每只20 mg/kg,连续3 d,注射后开始造皮肤溃疡模型,4%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉,再用电动推将大鼠背部长毛脱去,面积约4 cm×4 cm,在脱毛区用直径为2.5 cm的圆形塑料环标记造模区域,在无菌条件下剪去造模区全层皮肤,深达筋膜,将事先准备好的塑料环埋入除正常组外大鼠溃疡皮肤下,用手术线将其缝合固定。用6层纱布包扎固定。因造模、操作等原因每组大鼠有1～2只死亡。
2.2给药
造模第2日根据创面大小,正常组及模型组给予凡士林纱条,全方组给予全方纱条,益气组给予温阳益气拆方纱条,活血组给予活血生肌拆方纱条。剪取与创面大小相应药膏纱条贴敷于创面上,用医用纱布和橡皮膏固定,每日换药1次。
2.3样本收集与处理
给药1、3、5、7、14 d时,每组腹主动脉取血处死大鼠,静置30 min,4 ℃、3000 r/min离心15 min,取上层血清,-20 ℃冷冻保存,备用。
2.4血清白细胞介素-1α、血栓素B2含量测定
按照试剂盒说明方法操作,酶标仪450 nm处测定OD值。
3统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据均以—x±s表示,组间均数比较采用方差分析,两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
4结果
4.1回阳生肌膏及其拆方对大鼠血清白细胞介素-1α含量的影响
给药1 d,模型组、活血组IL-1α含量降低,与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；给药3 d,益气组IL-1α含量明显升高,与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05),模型组、全方组、活血组与益气组比较差异有统计学意义(P＜0.05),全方组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；给药5 d,全方组IL-1α含量明显升高,与空白组、正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；给药7 d,全方组、益气组、活血组IL-1α含量均升高,与空白组、正常组、模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),益气组、活血组与全方组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；给药14 d,模型组、活血组IL-1α含量降低，与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表1。
表1各组大鼠不同时点血清IL-1α含量比较(—x±s,pg/mL)
组别 只数 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d
空白组 4 3.57±0.06 3.57±0.06 3.57±0.06 3.57±0.06 3.57±0.06
正常组 4 3.43±0.07 3.51±0.07 3.64±0.03 3.61±0.01 3.23±0.12
模型组 4 3.37±0.05▲ 3.49±0.12◆ 3.65±0.07 3.68±0.04 2.87±0.12▲
全方组 4 3.47±0.01 3.46±0.02◆* 4.07±0.29▲★ 4.27±0.06▲★**◆☆ 3.32±0.20
益气组 4 3.49±0.00 3.79±0.07▲ 3.80±0.04 4.05±0.04▲★** 3.07±0.15
活血组 4 3.40±0.04▲ 3.47±0.01◆ 3.69±0.10 4.01±0.08▲★** 2.83±0.16▲
注：与空白组比较,▲P＜0.05；与正常组比较,★P＜0.05；与益气组比较,◆P＜0.05；与全方组比较,#P＜0.05；与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01,
与活血组比较,☆P＜0.05(下同)
4.2回阳生肌膏及其拆方对大鼠血清中血栓素B2含量的影响
给药1 d,各组TXB2含量无明显变化,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；给药3 d,与空白组比较,正常组、全方组TXB2含量升高,差异有统计学意义(P＜0.05)；给药5 d,全方组TXB2含量高于其他各组,差异有统计学意义(P＜0.05)。给药7、14 d的血清TXB2含量由同批次第2个试剂盒检测,因而空白组含量与1、3、5 d不同。给药7 d,益气组与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；给药14 d,模型组、全方组、益气组、活血组与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05),活血组与正常组、模型组、全方组、益气组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表2。
表2各组大鼠不同时点血清TXB2含量比较(—x±s,pg/mL)
组别 只数 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d
空白组 4 2.22±0.36 2.22±0.36 2.22±0.36 1.96±0.15 1.96±0.15
正常组 4 2.62±0.34 3.67±0.29▲ 2.42±0.03 2.15±0.09 2.32±0.12☆
模型组 4 3.05±0.10 3.33±0.19 2.37±0.31 2.35±0.83 2.70±0.13▲☆
全方组 4 2.31±0.30 3.89±0.19▲ 4.23±0.11▲★*◆☆ 2.39±0.05 2.84±0.15▲☆
益气组 4 2.09±0.54 3.49±0.34 3.03±0.13 3.61±0.02▲★#*☆ 2.85±0.19▲☆
活血组 4 2.55±0.10 2.68±0.19 2.40±0.31 2.41±0.10 3.45±0.11▲★*#◆
5讨论
慢性皮肤溃疡患者多表现为疮面平塌或下陷、渗液清稀、光亮如镜、疮周紫黯,且伴神疲气少等全身症状。中医多认为此症属“阴证”疮疡。元朝齐德之《外科精义》中对此症的表现及形成机制描述道：“凡诸疮疽脓水清稀,疮口不合,聚肿不赤,肌寒肉冷,自汗色脱者,气血之虚也。”明朝陈实功《外科正宗》对此症的治疗亦有说法：“但诸疮原因气血凝滞而成,切不可纯用凉药,冰凝肌肉,多致难腐难敛,必当温暖散滞、行瘀拔毒、活血药用之,方为妥当也。”
赵炳南、王玉章等名老中医认为慢性皮肤溃疡病机为阳气虚衰、精血不足,治宜温阳益气、活血通络、生肌敛疮,并研制了“回阳生肌散”外用方药,方用肉桂、炮姜、人参等温阳益气,川芎、白蔹等活血敛疮。前期研究已模拟出与临床阴证疮疡表现相似的大鼠模型[2],并在此基础上对回阳生肌散及其拆方对促进皮肤溃疡愈合的作用机制进行了探讨。
疮面愈合是一个动态而连续的过程,包括炎症反应期、肉芽组织形成期、基质形成和重塑期。炎症反应是疮面愈合的第一个阶段,IL-1α是炎性反应和免疫应答中的重要细胞因子,可参与免疫调节、介导炎性反应及致热作用,还可直接刺激血管内皮细胞参与创面的炎症过程,可诱导成纤维细胞的增生和平滑肌细胞的增殖,促进伤口愈合,刺激造血功能[3]。有研究表明,IL-1α在伤后5 h出现第一次表达高峰,且IL-1α可直接产生于血管内皮细胞而在血管炎症反应中发挥重要作用[4]。由于模型中氢化可的松对免疫的抑制作用,故而在给药1 d时,IL-1α的含量均偏低；给药3 d时益气组IL-1α含量均显著高于其他各组；给药5～7 d时,全方组及益气组IL-1α含量均高于其他各组,说明温阳益气类药物在早期有促进炎症反应的作用,使阴证疮疡的疮面由“阴”转“阳”。有研究表明,糖尿病微血管病变所致的皮肤溃疡和邻近伤口的健康组织中TXB2的浓度较其他组织高[5-6],TXB2有强烈收缩血管平滑肌及聚集血小板的作用[7],它的升高与伤口瘀阻有关。给药3、5 d时全方组TXB2含量高于其他组,给药7 d,益气组高于其他组,表明早期大鼠在炎症和氧化应激等多种因素刺激下血小板活化,导致血管收缩、微循环中血小板黏附聚集而阻滞血流[8]。给药14 d,正常组此时基本痊愈,TXB2含量与空白组相近,而模型组和各给药组含量均升高,且活血组含量尤其高,可能由于在实验过程中对伤口的刺激作用,使血小板活化而产生TXB2,使这一指标不能真实地反映体内TXB2的生成水平[9]。
回阳生肌膏及其拆方均能对糖尿病慢性皮肤溃疡促进炎症反应,刺激炎症因子分泌,益气温阳药对创面的促炎作用在早期更为明显,回阳生肌膏全方在给药5 d后效果明显,与“阳生阴长”理论提出的温阳益气为慢性皮肤溃疡愈合的启动因子相符,回阳生肌膏在温阳益气和养血活血的作用下,效果显著。
参考文献：
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[2] 李媛,赵光明,董建勋,等.探讨中医病证相符的糖尿病慢性皮肤溃疡大鼠造模方法[J].中国实验动物学报,2014,22(1)：41-46.
[3] 丁韧,汤雪明.创伤愈合的细胞生物学研究进展[J].创伤外科杂志, 2000,2(1)：59-62.
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[7] 顾家珍,夏正远.复方丹参对体外循环患者血清内皮素和血栓素水平的影响[J].中华麻醉学杂志,1998,18(12)：722-727.
[8] 江欢,周岩,孙晓红,等.中医“热毒血瘀证”模型大鼠血管内皮损伤及血小板功能障碍研究[J].中西医结合心脑血管病杂志,2009,7(4)：425-428.
[9] 卢国元,沈蕾,谢燕,等.血管内皮生长因子及花生四烯酸代谢紊乱在糖尿病肾病中的作用[J].苏州大学学报：医学版,2005,25(6)：1020-1022.
(收稿日期：2013-12-05；编辑：华强)
关键词：回阳生肌膏；慢性皮肤溃疡；白细胞介素-1α；血栓素B2；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.07.013
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1005-5304(2014)07-0043-04
Influence of Huiyang Shengji Ointment and Its Modified Formulae on Serum Interleukin-1α and Thromboxane B2 in Diabetic Rats with Chronic Skin UlcersLI Yuan1,2, ZHAO Guang-ming2, DONG Jian-xun1, LU Guang-lin2, ZHANG Xu-hui2, XU Xu-ying1, WEI Ran-ran2, CHEN Bo2 (1.Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100010, China；2.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)
Abstract：Objective To observe the influence of Huiyang Shengji Ointment and its modified formulae on interleukin-1 (IL-1) and thromboxane B2 (TXB2) in diabetic rats with chronic skin ulcers, and explore the mechanism for promoting the healing of ulcer. Methods Six out of 160 rats were randomly selected as a blank group, without any further processing. The remaining rats were made diabetic model and randomly divided into five groups after 2 weeks：1 d, 3 d, 5 d, 7 d and 14 d groups. Then, these groups were further divided into normal group (Vaseline ointments), model group (Vaseline ointments), Huiyang Shengji Ointment group (whole formula Ointment), Wenyang Yiqi group (Yiqi group, modified Wenyang Yiqi formula ointments) and Huoxue Shengji group (Huoxue group, modified Huoxue Shengji formula ointments). Normal group and model group were given Vaseline ointments；whole formula group, Yiqi group and Huoxue group were given corresponding ointment. Normal group used the method of skin excision, while other groups used
基金项目：国家自然科学基金(81072808)；北京市教育委员会科技计划项目(KM201110025023)；
北京市高层次卫生技术人才学科带头人项目(2011-2-14)
通讯作者：路广林,E-mail：Lugl66@sina.com
STZ injection-hydrocortisone interference-skin excision-foreign body embedded preparation of composite factors for chronic skin ulcer model. After the appropriate treatment period, the rats were executed and tested for the contents of IL-1 and TXB2 in serum by enzyme-linked immunosorbent assay of five time points. Results In treatment 3 d, the contents of IL-1 in Yiqi group were significantly higher than the blank group, model group, whole formula group and Huoxue group (P＜0.05). In treatment 5 d, the contents of IL-1 in whole formula group were significantly higher than the blank group and model group (P＜0.05). In treatment 7 d, the contents of IL-1 in each treatment group were significantly higher than blank group and model group (P＜0.05), and the whole formula group was higher than the Yiqi group and Huoxue group. In treatment 14 d, the contents of IL-1 in model group and Huoxue group were lower than the blank group (P＜0.05). In treatment 3 d, the contents of TXB2 in normal group and the whole formula group were higher than the blank group (P＜0.05). In treatment 5 d, the contents of TXB2 in whole formula group were higher than the blank group and the normal group (P＜0.05). In treatment 7 d, the contents of TXB2 in Yiqi group were higher than the blank, the model, the whole formula and Huoxue groups (P＜0.05). In treatment 14 d, the contents of TXB2 in Huoxue group were higher than the blank and model group (P＜0.05), and the contents of TXB2 in the blank group and normal group was lower than those treatment groups (P＜0.05). Conclusion Huiyang Shengji Ointment and its modified formulae could promote inflammation, stimulate secretion of inflammatory cytokines, while Yiqi Wenyang ointments played a more active role in promoting inflammation of the early phase of wound surface.
Key words：Huiyang Shengji Ointment；chronic skin ulcer；IL-1；TXB2；rats
近年来,随着糖尿病的发病率增高,糖尿病慢性皮肤溃疡的发病率也逐年上升,病程迁延,治疗疗效差,对患者的生活质量造成了极大的影响。中医对慢性难愈性疾病的治疗有悠久的历史和丰富的经验,首都医科大学附属北京中医医院赵炳南、王玉章等已故名老中医创立的回阳生肌膏,对慢性皮肤溃疡的阴证疮疡有显著疗效。前期研究表明,回阳生肌膏中温阳益气类药物对慢性皮肤溃疡大鼠创面有促进炎症反应和愈合作用[1]。本实验观察回阳生肌膏及其拆方对糖尿病慢性皮肤溃疡大鼠不同时点血清中白细胞介素-1α(IL-1α)和血栓素B2(TXB2)含量的影响,以进一步完善“阳生阴长”理论,探讨其促进糖尿病慢性皮肤溃疡愈合的作用机制。
1实验材料
1.1动物
SD大鼠160只,雄性,体质量(220±20)g,SPF级。购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号：SCXK(京)2012-0001。饲养于SPF级动物房内,无菌手术在中国中医科学院中药研究所屏障动物实验设施内进行,温度20～22 ℃,相对湿度40%～60%,12 h光照、12 h避光循环饲养。
1.2药物
回阳生肌散、温阳益气拆方散、活血生肌拆方散、凡士林,均由首都医科大学附属北京中医医院制剂中心提供,批号20120516。回阳生肌散由肉桂、炮姜、人参、黄芪、川芎、芥子、白蔹组成；温阳益气拆方散由肉桂、炮姜、人参、黄芪、芥子组成；活血生肌拆方散由川芎、当归、白蔹组成。取回阳生肌散药粉、各拆方散药粉(各按药物比例取回阳生肌散中益气/活血等量药粉,余下量取对照粉末与拆方散药混匀,粉末总质量与回阳生肌散相等)与凡士林以1∶4比例混匀调成膏剂,均匀涂抹在纱布上制成药膏纱条。氢化可的松注射液(浓度5 g/L),购自天津金耀氨基酸有限公司。
1.3主要试剂与仪器
链脲佐菌素(STZ,货号：S0130)、柠檬酸、柠檬酸钠均购自上海前尘生物科技有限公司；血糖仪及其配套试纸均为罗氏公司产品(德国)。酶联免疫分析试剂盒、IL-1α试剂盒(批号Q03038392)、TXB2试剂盒(批号P15038388)均购自武汉华美生物工程有限公司。多功能酶标仪(Thermo公司)。
2实验方法
2.1分组与造模
将160只大鼠随机抽取6只作为空白组,不做任何处理。其余大鼠适应性喂养3 d后,实验前大鼠禁食不禁水12 h,称重。临用前配制0.1 mol/L、pH 4.2～4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及1%STZ溶液,冰浴放置。根据大鼠体质量,腹腔注射STZ 55 mg/kg；正常组注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。在注射STZ后72 h测量随机非空腹血糖,随机血糖＞16.7 mmol/L为糖尿病模型成模,未成模者每只补打20 mg/kg；全部成模2周后,根据大鼠体质量随机分为5个时间点,每时点30只,每时点再分5组,每组6只,分别为正常组、模型组,回阳生肌膏组(全方组)、温阳益气拆方组(益气组)、活血生肌拆方组(活血组)。分组后经大鼠股部肌肉注射氢化可的松每只20 mg/kg,连续3 d,注射后开始造皮肤溃疡模型,4%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉,再用电动推将大鼠背部长毛脱去,面积约4 cm×4 cm,在脱毛区用直径为2.5 cm的圆形塑料环标记造模区域,在无菌条件下剪去造模区全层皮肤,深达筋膜,将事先准备好的塑料环埋入除正常组外大鼠溃疡皮肤下,用手术线将其缝合固定。用6层纱布包扎固定。因造模、操作等原因每组大鼠有1～2只死亡。
2.2给药
造模第2日根据创面大小,正常组及模型组给予凡士林纱条,全方组给予全方纱条,益气组给予温阳益气拆方纱条,活血组给予活血生肌拆方纱条。剪取与创面大小相应药膏纱条贴敷于创面上,用医用纱布和橡皮膏固定,每日换药1次。
2.3样本收集与处理
给药1、3、5、7、14 d时,每组腹主动脉取血处死大鼠,静置30 min,4 ℃、3000 r/min离心15 min,取上层血清,-20 ℃冷冻保存,备用。
2.4血清白细胞介素-1α、血栓素B2含量测定
按照试剂盒说明方法操作,酶标仪450 nm处测定OD值。
3统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据均以—x±s表示,组间均数比较采用方差分析,两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
4结果
4.1回阳生肌膏及其拆方对大鼠血清白细胞介素-1α含量的影响
给药1 d,模型组、活血组IL-1α含量降低,与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；给药3 d,益气组IL-1α含量明显升高,与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05),模型组、全方组、活血组与益气组比较差异有统计学意义(P＜0.05),全方组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；给药5 d,全方组IL-1α含量明显升高,与空白组、正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；给药7 d,全方组、益气组、活血组IL-1α含量均升高,与空白组、正常组、模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),益气组、活血组与全方组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；给药14 d,模型组、活血组IL-1α含量降低，与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表1。
表1各组大鼠不同时点血清IL-1α含量比较(—x±s,pg/mL)
组别 只数 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d
空白组 4 3.57±0.06 3.57±0.06 3.57±0.06 3.57±0.06 3.57±0.06
正常组 4 3.43±0.07 3.51±0.07 3.64±0.03 3.61±0.01 3.23±0.12
模型组 4 3.37±0.05▲ 3.49±0.12◆ 3.65±0.07 3.68±0.04 2.87±0.12▲
全方组 4 3.47±0.01 3.46±0.02◆* 4.07±0.29▲★ 4.27±0.06▲★**◆☆ 3.32±0.20
益气组 4 3.49±0.00 3.79±0.07▲ 3.80±0.04 4.05±0.04▲★** 3.07±0.15
活血组 4 3.40±0.04▲ 3.47±0.01◆ 3.69±0.10 4.01±0.08▲★** 2.83±0.16▲
注：与空白组比较,▲P＜0.05；与正常组比较,★P＜0.05；与益气组比较,◆P＜0.05；与全方组比较,#P＜0.05；与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01,
与活血组比较,☆P＜0.05(下同)
4.2回阳生肌膏及其拆方对大鼠血清中血栓素B2含量的影响
给药1 d,各组TXB2含量无明显变化,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；给药3 d,与空白组比较,正常组、全方组TXB2含量升高,差异有统计学意义(P＜0.05)；给药5 d,全方组TXB2含量高于其他各组,差异有统计学意义(P＜0.05)。给药7、14 d的血清TXB2含量由同批次第2个试剂盒检测,因而空白组含量与1、3、5 d不同。给药7 d,益气组与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；给药14 d,模型组、全方组、益气组、活血组与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05),活血组与正常组、模型组、全方组、益气组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表2。
表2各组大鼠不同时点血清TXB2含量比较(—x±s,pg/mL)
组别 只数 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d
空白组 4 2.22±0.36 2.22±0.36 2.22±0.36 1.96±0.15 1.96±0.15
正常组 4 2.62±0.34 3.67±0.29▲ 2.42±0.03 2.15±0.09 2.32±0.12☆
模型组 4 3.05±0.10 3.33±0.19 2.37±0.31 2.35±0.83 2.70±0.13▲☆
全方组 4 2.31±0.30 3.89±0.19▲ 4.23±0.11▲★*◆☆ 2.39±0.05 2.84±0.15▲☆
益气组 4 2.09±0.54 3.49±0.34 3.03±0.13 3.61±0.02▲★#*☆ 2.85±0.19▲☆
活血组 4 2.55±0.10 2.68±0.19 2.40±0.31 2.41±0.10 3.45±0.11▲★*#◆
5讨论
慢性皮肤溃疡患者多表现为疮面平塌或下陷、渗液清稀、光亮如镜、疮周紫黯,且伴神疲气少等全身症状。中医多认为此症属“阴证”疮疡。元朝齐德之《外科精义》中对此症的表现及形成机制描述道：“凡诸疮疽脓水清稀,疮口不合,聚肿不赤,肌寒肉冷,自汗色脱者,气血之虚也。”明朝陈实功《外科正宗》对此症的治疗亦有说法：“但诸疮原因气血凝滞而成,切不可纯用凉药,冰凝肌肉,多致难腐难敛,必当温暖散滞、行瘀拔毒、活血药用之,方为妥当也。”
赵炳南、王玉章等名老中医认为慢性皮肤溃疡病机为阳气虚衰、精血不足,治宜温阳益气、活血通络、生肌敛疮,并研制了“回阳生肌散”外用方药,方用肉桂、炮姜、人参等温阳益气,川芎、白蔹等活血敛疮。前期研究已模拟出与临床阴证疮疡表现相似的大鼠模型[2],并在此基础上对回阳生肌散及其拆方对促进皮肤溃疡愈合的作用机制进行了探讨。
疮面愈合是一个动态而连续的过程,包括炎症反应期、肉芽组织形成期、基质形成和重塑期。炎症反应是疮面愈合的第一个阶段,IL-1α是炎性反应和免疫应答中的重要细胞因子,可参与免疫调节、介导炎性反应及致热作用,还可直接刺激血管内皮细胞参与创面的炎症过程,可诱导成纤维细胞的增生和平滑肌细胞的增殖,促进伤口愈合,刺激造血功能[3]。有研究表明,IL-1α在伤后5 h出现第一次表达高峰,且IL-1α可直接产生于血管内皮细胞而在血管炎症反应中发挥重要作用[4]。由于模型中氢化可的松对免疫的抑制作用,故而在给药1 d时,IL-1α的含量均偏低；给药3 d时益气组IL-1α含量均显著高于其他各组；给药5～7 d时,全方组及益气组IL-1α含量均高于其他各组,说明温阳益气类药物在早期有促进炎症反应的作用,使阴证疮疡的疮面由“阴”转“阳”。有研究表明,糖尿病微血管病变所致的皮肤溃疡和邻近伤口的健康组织中TXB2的浓度较其他组织高[5-6],TXB2有强烈收缩血管平滑肌及聚集血小板的作用[7],它的升高与伤口瘀阻有关。给药3、5 d时全方组TXB2含量高于其他组,给药7 d,益气组高于其他组,表明早期大鼠在炎症和氧化应激等多种因素刺激下血小板活化,导致血管收缩、微循环中血小板黏附聚集而阻滞血流[8]。给药14 d,正常组此时基本痊愈,TXB2含量与空白组相近,而模型组和各给药组含量均升高,且活血组含量尤其高,可能由于在实验过程中对伤口的刺激作用,使血小板活化而产生TXB2,使这一指标不能真实地反映体内TXB2的生成水平[9]。
回阳生肌膏及其拆方均能对糖尿病慢性皮肤溃疡促进炎症反应,刺激炎症因子分泌,益气温阳药对创面的促炎作用在早期更为明显,回阳生肌膏全方在给药5 d后效果明显,与“阳生阴长”理论提出的温阳益气为慢性皮肤溃疡愈合的启动因子相符,回阳生肌膏在温阳益气和养血活血的作用下,效果显著。
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(收稿日期：2013-12-05；编辑：华强)