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摘要：目的 研究应用傅立叶变换红外光谱鉴别金银花挥发油的方法。方法 用水蒸气蒸馏结合正己烷连续液-液萃取法提取金银花、山银花的挥发油；将挥发油溶液滴在溴化钾窗片上，待溶剂挥发后形成油膜，用傅立叶变换红外光谱法测定红外光谱；将红外光谱进行基线趋势去除和曲线平滑处理；选取1800～850 cm-1范围内光谱数据作为特征光谱进行聚类分析，根据聚类分析结果区分金银花和山银花挥发油样品。结果 从少量金银花药材中提取到挥发油用于获取傅立叶变换红外光谱，所采用的数据分析方法能区分金银花和山银花挥发油。结论 本方法可以用于鉴别金银花挥发油。
关键词：金银花；山银花；挥发油；傅立叶变换红外光谱法；特征图谱；模式识别；鉴别
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.11.024
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）11-0063-03
2010年版《中华人民共和国药典（一部）》（以下简称《中国药典》）收载成方制剂“金银花露”，规定以金银花药材挥发油为主要药效成分，但收载的药材金银花、山银花品种没有挥发油质量控制项目[1]。因此，有必要研究合适的质量控制方法来鉴别金银花、山银花的挥发油成分。红外光谱鉴别法是一种专属性强的鉴别方法，多用于化学药的鉴别。中药提取物是混合物，红外光谱信息复杂，但采用化学计量学方法分析对其进行化学模式识别，可用于中药的鉴别[2-5]。本试验研究金银花、山银花挥发油的提取、红外制样、傅立叶变换红外光谱前处理和分析，用于建立金银花挥发油的鉴别方法，为鉴别金银花、山银花挥发油及用傅立叶变换红外光谱法进行中药鉴别提供参考。
1 仪器与试药
IRAffinity-1傅立叶红外光谱仪、溴化钾窗片来自日本
基金项目：广东省中医药局课题（20122071）
通讯作者：吴美珠，E-mail：zqwmz@163.com
岛津公司。无水硫酸钠、氯化钠、乙酸乙酯、乙醚、正己烷为分析纯，溴化钾为光谱纯。蒸馏水为实验室制备。自编的数据处理程序在NetBeans IDE 6.9.1（美国甲骨文公司）软件下用Java语言开发。相似度计算和聚类分析使用SPSS20.0软件（美国IBM公司）。
金银花样品包括：1号样品购自河南新乡，2号样品购自山东菏泽，3、4号样品购自山东平邑；山银花样品包括：5号样品购自湖南郴州（灰毡毛忍冬），6号样品购自广西桂林（黄褐毛忍冬），7号样品购自广东广州（华南忍冬），8号样品购自广东肇庆（红腺忍冬）。上述样品经唐铁鑫鉴定，标本存于肇庆医学高等专科学校。
2 方法与结果
2.1 样品制备方法
参考《中国药典》中“金银花露”项下样品处理方法[1]，称取20 g 样品粗粉，置250 mL圆底烧瓶中，加水100 mL、氯化钠20 g，并加入数粒玻璃珠。将烧瓶放入电热套中，连接挥发油测定器，自连接回流冷凝管处加水至溢流入烧瓶，再加入正己烷2 mL，连接回流冷凝管。开启电热套加热，从形成回流起计时，保持微沸2 h。停止加热，撤去回流管，分取有机层溶液至具塞离心管中，加入1 g无水硫酸钠，强烈振摇，放置备用。用前于5000 r/min离心5 min，取上清液测定。
2.2 傅立叶变换红外光谱测定方法
将经正己烷、无水乙醇洗涤干净并干燥好的空白溴化钾窗片放入红外光谱仪，扫描空白光谱图。将得到的含挥发油的有机溶液滴在溴化钾窗片上，每滴下1滴后待溶剂挥发后再滴，重复多次至形成一层油膜。将载有样品挥发油的溴化钾窗片放入红外光谱仪，扫描样品光谱图。扫描范围为4000～400 cm﹣1，扫描次数为20次。间隔3 min后重复测定1次。
2.3 傅立叶变换红外光谱数据分析方法
将光谱图数据（横坐标为波数cm-1，纵坐标为透光率T%）从IRSolution软件导出成文本数据。用自编软件进行数据处理，去除基线趋势并对曲线进行平滑。基线趋势去除算法为：用最小二乘法对样品的光谱数据进行二次曲线方程拟合[6]，将样品的光谱数据与相应波数代入拟合的曲线方程计算出来的数值比较，计算平均偏差，将各点的偏差与平均偏差比较，剔除偏差大于3倍平均偏差的点，将余下的数据点再拟合和剔除数据一次，将余下数据拟合成最终的基线趋势二次曲线方程，然后将原来的光谱数据减去相应波数代入拟合的曲线方程再次计算，从而得到新的光谱数据。曲线平滑算法采用窗口长度为11个数据点的中值滤波算法[7]。
各样品的红外光谱经过基线趋势去除和曲线平滑处理后，选取1800～850 cm-1范围的数据作为一维有序变量数组输入SPSS20.0软件，以Pearson相关性（相关系数法）作为区间，进行系统聚类分析，输出相似度矩阵和树状图结果，通过聚类分析结果鉴别金银花挥发油。
2.4 影响因素考察
2.4.1 萃取溶剂的比较 分别将乙醚、乙酸乙酯和正己烷用于萃取，测得的相应傅立叶变换红外光谱见图1。其中正己烷重复性最好，因此选用正己烷用于挥发油的萃取。
2.4.2 红外光谱的基线趋势去除和曲线平滑处理 基线趋势去除处理的效果见图2。图1C中2次测定得到的原始光谱图基线趋势有较大差别，处理后的图谱见图2。可以看到，经过处理后，2个图谱基本重叠在一起，表明所采用的算法是有效的。用中值滤波算法对红外光谱进行曲线平滑的效果见图3。参考文献[7]比较了不同的曲线平滑算法，选用了中值滤波算法。尝试了不同长度的数字滤波窗口，以11个点的效果最佳，可以在滤除噪音的同时较好地保留峰信息。
2.4.3 特征波数范围选择 将8个样本的光谱图叠加，如图4所示，3000 cm-1以上区域受到较大的干扰而且没有特征性，3000 cm-1由于-OH伸缩振动峰的重叠，特征性差。1800～2800 cm-1主要呈现为较平坦的基线，特征性不强。通过选取1800～400 cm-1范围内的光谱进行分析，发现如果将850 cm-1以下的数据包括进来，结果不理想。最终确定特征波数范围为1800～850 cm-1，8个样本的特征范围内的光谱图见图5。 3 讨论
色谱或光谱特征图谱是控制中药质量的有效方法，能反映中药的整体化学特征，成为鉴别中药真伪的国际公认方法[8]。2010年版《中国药典》首次收载了多个药材、饮片、提取物及制剂的特征图谱。红外光谱反映分子中所有主要功能基的吸收信号，任何药物分子的红外光谱都具有唯一性，所以，化学原料药普遍采用红外光谱来鉴别真伪。因为红外光谱都具有加和性，中药粉末或提取物是混合物，使用红外光谱法鉴别中药材存在专属性差、分辨率低的问题。但利用计算机技术和数学方法进行处理，并通过化学计量学方法进行化学模式识别，红外光谱法也可用于中药鉴别，而且与色谱特征图谱以相对保留时间为纵坐标相比，红外光谱特征图谱的纵坐标为光频率，重现性更好，更容易建立图谱数据库进行分析比较。因此，选择采用红外光谱技术结合特征图谱的模式识别进行金银花挥发油的鉴别。
金银花挥发油含量很低，通常的挥发油提取法收集挥发油进行涂膜制样需要大量金银花药材。为了减少取样量，本研究在挥发油测定器侧管加入有机溶剂进行连续萃取制备挥发油的溶液[1]，用于红外光谱测定。结果表明该制备方法是有效的。
本研究中获得的样品原始红外光谱基线变化大，噪音干扰大，因此需要进行基线趋势去除和曲线平滑处理，结果表明，基线趋势去除和曲线平滑处理能有效去除基线变化和噪音造成的干扰。由于挥发油的红外图谱是多种化学成分的混合图谱，各种信号叠加，而使用共有峰的峰面积或峰高作为矢量计算相似度无法体现峰型变化的差异，也就很难代表样品的差异。因此，本研究采用将特征波数范围内全谱数据作为向量用于聚类分析的方法。化学模式识别方法很多，系统聚类分析是一种非监督模式识别方法，不需要通过样品培训建模，普遍用于化学计量学研究中，因此本试验采用该法。在实际应用中，可以用正品和伪品金银花样品测定结果建立数据库，将待鉴别样品测定数据与数据库的数据进行聚类分析，根据是否先与正品样品数据聚类来确定真伪。
本研究的金银花和山银花挥发油傅立叶变换红外光谱鉴别方法包括样品提取、红外制样和傅立叶变换红外光谱测定、光谱前处理、特征范围内光谱聚类分析等步骤。通过8个样品的实际测定，能区别金银花和山银花挥发油，可用于鉴别金银花挥发油，对其他药材傅立叶变换红外光谱分析研究也具有参考价值。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：28-29，208-209，830-831，附录63.
[2] 陈亚，江滨，曾元儿.红外光谱在中药鉴别中的应用[J].广州中医药大学学报，2004，21（3）：237-240.
[3] 张石楠，张桂芝，张立.中药饮片挥发油的红外指纹图谱研究[J].现代中药研究与实践，2009，23（1）：25-27.
[4] Cheng C， Liu J， Wang H， et al. Infrared spectroscopic studies of Chinese medicines[J]. Applied Spectroscopy Reviews，2010，45：165-178.
[5] 袁玉峰，陶站华，刘军，等.红外光谱结合主成分分析鉴别不同产地黄柏[J].光谱学与光谱分析，2011，31（5）：1258-1261.
[6] Kiusalaas J. Numerical methods in engineering with python[M]. Cambridge，UK：Cambridge University Press，2005：103-141.
[7] Vaseghi SV. Advanced digital signal processing and noise reduction [M]. 3rd Edition. West Sussex，UK：John Wiley & Sons Ltd， 2006：319-336.
[8] WHO. WHO guidelines on good manufacturing practices （GMP） for herbal medicines[M]. Geneva：WHO Press，2007.
（收稿日期：2013-04-26，编辑：陈静）
关键词：金银花；山银花；挥发油；傅立叶变换红外光谱法；特征图谱；模式识别；鉴别
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.11.024
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）11-0063-03
2010年版《中华人民共和国药典（一部）》（以下简称《中国药典》）收载成方制剂“金银花露”，规定以金银花药材挥发油为主要药效成分，但收载的药材金银花、山银花品种没有挥发油质量控制项目[1]。因此，有必要研究合适的质量控制方法来鉴别金银花、山银花的挥发油成分。红外光谱鉴别法是一种专属性强的鉴别方法，多用于化学药的鉴别。中药提取物是混合物，红外光谱信息复杂，但采用化学计量学方法分析对其进行化学模式识别，可用于中药的鉴别[2-5]。本试验研究金银花、山银花挥发油的提取、红外制样、傅立叶变换红外光谱前处理和分析，用于建立金银花挥发油的鉴别方法，为鉴别金银花、山银花挥发油及用傅立叶变换红外光谱法进行中药鉴别提供参考。
1 仪器与试药
IRAffinity-1傅立叶红外光谱仪、溴化钾窗片来自日本
基金项目：广东省中医药局课题（20122071）
通讯作者：吴美珠，E-mail：zqwmz@163.com
岛津公司。无水硫酸钠、氯化钠、乙酸乙酯、乙醚、正己烷为分析纯，溴化钾为光谱纯。蒸馏水为实验室制备。自编的数据处理程序在NetBeans IDE 6.9.1（美国甲骨文公司）软件下用Java语言开发。相似度计算和聚类分析使用SPSS20.0软件（美国IBM公司）。
金银花样品包括：1号样品购自河南新乡，2号样品购自山东菏泽，3、4号样品购自山东平邑；山银花样品包括：5号样品购自湖南郴州（灰毡毛忍冬），6号样品购自广西桂林（黄褐毛忍冬），7号样品购自广东广州（华南忍冬），8号样品购自广东肇庆（红腺忍冬）。上述样品经唐铁鑫鉴定，标本存于肇庆医学高等专科学校。
2 方法与结果
2.1 样品制备方法
参考《中国药典》中“金银花露”项下样品处理方法[1]，称取20 g 样品粗粉，置250 mL圆底烧瓶中，加水100 mL、氯化钠20 g，并加入数粒玻璃珠。将烧瓶放入电热套中，连接挥发油测定器，自连接回流冷凝管处加水至溢流入烧瓶，再加入正己烷2 mL，连接回流冷凝管。开启电热套加热，从形成回流起计时，保持微沸2 h。停止加热，撤去回流管，分取有机层溶液至具塞离心管中，加入1 g无水硫酸钠，强烈振摇，放置备用。用前于5000 r/min离心5 min，取上清液测定。
2.2 傅立叶变换红外光谱测定方法
将经正己烷、无水乙醇洗涤干净并干燥好的空白溴化钾窗片放入红外光谱仪，扫描空白光谱图。将得到的含挥发油的有机溶液滴在溴化钾窗片上，每滴下1滴后待溶剂挥发后再滴，重复多次至形成一层油膜。将载有样品挥发油的溴化钾窗片放入红外光谱仪，扫描样品光谱图。扫描范围为4000～400 cm﹣1，扫描次数为20次。间隔3 min后重复测定1次。
2.3 傅立叶变换红外光谱数据分析方法
将光谱图数据（横坐标为波数cm-1，纵坐标为透光率T%）从IRSolution软件导出成文本数据。用自编软件进行数据处理，去除基线趋势并对曲线进行平滑。基线趋势去除算法为：用最小二乘法对样品的光谱数据进行二次曲线方程拟合[6]，将样品的光谱数据与相应波数代入拟合的曲线方程计算出来的数值比较，计算平均偏差，将各点的偏差与平均偏差比较，剔除偏差大于3倍平均偏差的点，将余下的数据点再拟合和剔除数据一次，将余下数据拟合成最终的基线趋势二次曲线方程，然后将原来的光谱数据减去相应波数代入拟合的曲线方程再次计算，从而得到新的光谱数据。曲线平滑算法采用窗口长度为11个数据点的中值滤波算法[7]。
各样品的红外光谱经过基线趋势去除和曲线平滑处理后，选取1800～850 cm-1范围的数据作为一维有序变量数组输入SPSS20.0软件，以Pearson相关性（相关系数法）作为区间，进行系统聚类分析，输出相似度矩阵和树状图结果，通过聚类分析结果鉴别金银花挥发油。
2.4 影响因素考察
2.4.1 萃取溶剂的比较 分别将乙醚、乙酸乙酯和正己烷用于萃取，测得的相应傅立叶变换红外光谱见图1。其中正己烷重复性最好，因此选用正己烷用于挥发油的萃取。
2.4.2 红外光谱的基线趋势去除和曲线平滑处理 基线趋势去除处理的效果见图2。图1C中2次测定得到的原始光谱图基线趋势有较大差别，处理后的图谱见图2。可以看到，经过处理后，2个图谱基本重叠在一起，表明所采用的算法是有效的。用中值滤波算法对红外光谱进行曲线平滑的效果见图3。参考文献[7]比较了不同的曲线平滑算法，选用了中值滤波算法。尝试了不同长度的数字滤波窗口，以11个点的效果最佳，可以在滤除噪音的同时较好地保留峰信息。
2.4.3 特征波数范围选择 将8个样本的光谱图叠加，如图4所示，3000 cm-1以上区域受到较大的干扰而且没有特征性，3000 cm-1由于-OH伸缩振动峰的重叠，特征性差。1800～2800 cm-1主要呈现为较平坦的基线，特征性不强。通过选取1800～400 cm-1范围内的光谱进行分析，发现如果将850 cm-1以下的数据包括进来，结果不理想。最终确定特征波数范围为1800～850 cm-1，8个样本的特征范围内的光谱图见图5。 3 讨论
色谱或光谱特征图谱是控制中药质量的有效方法，能反映中药的整体化学特征，成为鉴别中药真伪的国际公认方法[8]。2010年版《中国药典》首次收载了多个药材、饮片、提取物及制剂的特征图谱。红外光谱反映分子中所有主要功能基的吸收信号，任何药物分子的红外光谱都具有唯一性，所以，化学原料药普遍采用红外光谱来鉴别真伪。因为红外光谱都具有加和性，中药粉末或提取物是混合物，使用红外光谱法鉴别中药材存在专属性差、分辨率低的问题。但利用计算机技术和数学方法进行处理，并通过化学计量学方法进行化学模式识别，红外光谱法也可用于中药鉴别，而且与色谱特征图谱以相对保留时间为纵坐标相比，红外光谱特征图谱的纵坐标为光频率，重现性更好，更容易建立图谱数据库进行分析比较。因此，选择采用红外光谱技术结合特征图谱的模式识别进行金银花挥发油的鉴别。
金银花挥发油含量很低，通常的挥发油提取法收集挥发油进行涂膜制样需要大量金银花药材。为了减少取样量，本研究在挥发油测定器侧管加入有机溶剂进行连续萃取制备挥发油的溶液[1]，用于红外光谱测定。结果表明该制备方法是有效的。
本研究中获得的样品原始红外光谱基线变化大，噪音干扰大，因此需要进行基线趋势去除和曲线平滑处理，结果表明，基线趋势去除和曲线平滑处理能有效去除基线变化和噪音造成的干扰。由于挥发油的红外图谱是多种化学成分的混合图谱，各种信号叠加，而使用共有峰的峰面积或峰高作为矢量计算相似度无法体现峰型变化的差异，也就很难代表样品的差异。因此，本研究采用将特征波数范围内全谱数据作为向量用于聚类分析的方法。化学模式识别方法很多，系统聚类分析是一种非监督模式识别方法，不需要通过样品培训建模，普遍用于化学计量学研究中，因此本试验采用该法。在实际应用中，可以用正品和伪品金银花样品测定结果建立数据库，将待鉴别样品测定数据与数据库的数据进行聚类分析，根据是否先与正品样品数据聚类来确定真伪。
本研究的金银花和山银花挥发油傅立叶变换红外光谱鉴别方法包括样品提取、红外制样和傅立叶变换红外光谱测定、光谱前处理、特征范围内光谱聚类分析等步骤。通过8个样品的实际测定，能区别金银花和山银花挥发油，可用于鉴别金银花挥发油，对其他药材傅立叶变换红外光谱分析研究也具有参考价值。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：28-29，208-209，830-831，附录63.
[2] 陈亚，江滨，曾元儿.红外光谱在中药鉴别中的应用[J].广州中医药大学学报，2004，21（3）：237-240.
[3] 张石楠，张桂芝，张立.中药饮片挥发油的红外指纹图谱研究[J].现代中药研究与实践，2009，23（1）：25-27.
[4] Cheng C， Liu J， Wang H， et al. Infrared spectroscopic studies of Chinese medicines[J]. Applied Spectroscopy Reviews，2010，45：165-178.
[5] 袁玉峰，陶站华，刘军，等.红外光谱结合主成分分析鉴别不同产地黄柏[J].光谱学与光谱分析，2011，31（5）：1258-1261.
[6] Kiusalaas J. Numerical methods in engineering with python[M]. Cambridge，UK：Cambridge University Press，2005：103-141.
[7] Vaseghi SV. Advanced digital signal processing and noise reduction [M]. 3rd Edition. West Sussex，UK：John Wiley & Sons Ltd， 2006：319-336.
[8] WHO. WHO guidelines on good manufacturing practices （GMP） for herbal medicines[M]. Geneva：WHO Press，2007.
（收稿日期：2013-04-26，编辑：陈静）