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【摘要】 目的 研究大鼠重型脑损伤后去大骨瓣减压组和非去大骨瓣减压组NF-κB的表达变化。方法 应用改良Feeney’s自由落体脑损伤打击装置制成大鼠重型脑损伤模型，运用免疫组化染色法检测假手术组、非去大骨瓣减压组和去大骨瓣减压组在不同时间点NF-κB的表达。结果 假手术组无明显阳性表达，实验组各个时间点均有不同程度阳性表达，其阳性细胞数呈现一个动态的变化过程：伤后6h在伤灶及其周围即有多量阳性细胞，12h阳性细胞数继续增加，24h明显增加并达到高峰，然后迅速下降；NDC组与DC组在24h，72h，120h及168h比较差异有显著性。结论 去大骨瓣减压可能通过降低NF-κB表达继而减轻炎症反应来减轻二次脑损伤。
【关键词】 去大骨瓣减压；重型颅脑损伤；NF-κB
文章编号：1004-7484（2013）-02-0555-02
创伤性脑损伤是世界性的多发性疾病，也是死亡率和致残率最高的疾病之一。研究认为NF-κB的活化是引发脑外伤后继发性生化级联反应的关键步骤，在创伤性脑水肿的病理生理发生发展过程中有着重要的作用[1]。本研究通过比较去大骨瓣减压组和非去大骨瓣减压组大鼠重型脑损伤后NF-κB的表达，拟探讨NF-κB在去大骨瓣减压的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组 SPF级成年SD大鼠90只，雌雄不限，体重250-350g，由汕头大学医学院实验动物中心提供。随机分为假手术组（简称SH组，6只），非去大骨瓣减压组（简称NDC组，42只）和去大骨瓣减压组（简称DC组，42只）（打击后6h、12h、24h、48h、72h、120h和168h各6只）。如果有死亡，则选择备用大鼠重新造模，补充至预定样本数。
1.2 模型的建立 动物模型采用改良Feeney's自由落体脑损伤装置制成。实验大鼠经2%戊巴比妥钠（45mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，头顶正中稍偏右纵行切开头皮约2.0cm，剥离骨膜，暴露右顶骨，用微型颅钻在冠状缝后1.5mm，中线旁2.0mm处钻一直径5.0mm骨窗，保持硬膜完整。将撞击圆锥置于硬膜上，用40g砝码于25cm高处沿空心导管坠落，通过撞击圆锥间接撞击硬膜，致右顶叶重型脑挫裂伤，打击后计时。NDC组大鼠止血后骨蜡封闭骨窗，缝合头皮；DC组同时行去大骨瓣减压术，形成大小约0.8cm×1.0cm减压骨窗，放射状剪开硬膜，止血后缝合头皮；SH组仅钻孔，不打击。
1.3 标本处理 各时间点每组6只大鼠过量麻醉后快速断头取脑，在冰盘上切取脑挫裂伤灶脑组织块，迅速用4%多聚甲醛液固定24h后常规脱水、石蜡包埋，每个标本切片厚度5um，用于NF-κB和免疫组化染色。
1.4 免疫组化染色及阳性细胞计数 采用链霉素亲和素—生物素—过氧化酶复合物法（SABC法），参照试剂盒说明书进行染色，一抗为NFκB p65（F-6）（浓度为1：50，购自美国SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC），使用已知阳性切片做阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗进行免疫组化染色。
每张切片随机选取10个不重复视野（各组所选部位尽可能相同），在高倍（10×40）镜下观察（相同条件），运用HMIAS-2000高清晰度图像采集处理系统采图。采用直接计数法计算每个视野下阳性细胞数目，取其均值表示各切片的测定结果。
1.5 数据处理 结果以 表示，用SPSS13.0 for Windows及Excel 软件进行统计处理。多组间均数的两两比较采用单因素方差分析，显著性水平为0.05。
2 结果
胞浆和（或）胞核有颗粒状及条索状棕黄色沉淀为NF-κB阳性表达的细胞，不仅分布在血脑屏障的内皮细胞上，还可出现在神经元、神经胶质细胞、脑室壁和脉络丛的细胞上以及血管壁平滑肌细胞上，以内皮细胞表達为主、其次是星型胶质细胞。
假手术组无明显阳性表达，在损伤组各时间点均有NF-κB阳性表达的细胞，但阳性细胞数呈现一个动态的变化过程。脑损伤后6h在损伤灶及其周围皮质即有多量的NF-κB阳性细胞；脑损伤后12h阳性细胞数继续增加；脑损伤后24h，损伤区及其周围NF-κB阳性细胞数量明显增加，达到高峰，然后迅速下降；脑损伤后48h-168hNF-κB阳性细胞数逐渐下降。NDC组与DC组变化曲线相似，但NDC组在每个时间点的阳性细胞数均高于DC组，其中在24h、72h及168h差异有高度显著性（P<0.01），120h差异有显著性（P<0.05），但48h差异无显著性，见表1，图1、2。
3 讨论
标准外伤大骨瓣开颅术在临床上应用已三十多年，其基础与临床研究均取得了较大进步，但目前国内外在分子水平上的实验研究较少。随着医学分子生物学、免疫学、神经生物学的飞速发展，目前对脑损伤的研究已经深入到亚细胞及分子水平。NF-κB是在1986年由Sen和Baltimore[2]应用凝胶电泳迁移率实验（EMSA）分析B细胞核提取物中发现的，因参与B细胞κ轻链的表达调控而得名。NF-κB是一组真核细胞转录因子，由NF-κB/Rel蛋白家族成员NF-κB1（p50，其前体p105），NF-κB2（p52，其前体p100），RelA（p65），RelB和C-Rel以同源或异源二聚体。
近年来发现NF-κB在神经系统中广泛表达，是与脑损伤后脑组织中免疫应答反应密切相关的细胞因子，它与神经系统许多生理、病理生理活动密切相关。
越来越多的研究显示脑炎性反应在颅脑外伤后的继发性脑损伤中发挥着重要作用[3]。近年对炎症本质的研究取得了较大进展，即发现炎症的发生主要与核转录因子，特别是NF-κB有关，NF-κB的活化是引发脑外伤继发性生化级联反应的关键步骤，在TBE病理生理的发生发展过程中有着重要的作用[1]。 在目前的神經损伤模型中，无论是中枢神经还是周围神经损伤，均可见NF-κB的激活。研究认为NF-κB存在于神经系统几乎所有类型的细胞中，主要包括神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞、少突细胞和神经干细胞，甚至在突触上也发现了NF-κB的定位。但本研究发现：NF-κB表达较强的位置主要在血管内皮细胞，其次是神经胶质细胞；脑损伤后6h脑组织NF-κB活性即增高，并逐渐增强，于伤后24h达高峰后迅速下降，Nonaka等[4]报道，在创伤性脑损伤大鼠中大脑皮层NF-κB活性在伤后数小时内显著增高，并至少持续24h维持在高水平状态，与我们的研究结果相符。48h-168h逐渐下降；NDC组与DC组变化曲线相似，但NDC组在每个时间点的阳性细胞数均高于DC组，其中在24h、72h及168h差异有高度显著性（P<0.01），120h差异有显著性（P<0.05），但48h差异无显著性。
研究认为NF-κB在内皮细胞，尤其是在炎症反应时的内皮细胞中起“枢纽”作用[5]。脑损伤后早期NF-κBp65在血管内皮细胞和神经胶质细胞中即可被激活，提示NF-κB在调控自由落体脑损伤后的多个病理生理过程中，这两类细胞可能起主要作用；内皮细胞激活是炎症反应的关键步骤，炎性损伤起初发生在脑的微血管内皮细胞和神经胶质细胞，随即累及周围的神经组织。因此我们推测：①脑损伤后NF-κBp65可早期被激活，NF-κB在调控TBI后多个病理生理过程中，血管内皮细胞和神经胶质细胞可能起着更为重要的作用，内皮细胞激活是炎症反应的关键步骤，炎性损伤最初发生在脑的微血管内皮细胞，随即累及周围的神经组织，激活的内皮细胞在转录因子，特别是在NF-κB系统的调节下，介导或直接参与白细胞与血管内皮细胞的相互作用以及血管和组织的损伤；②损伤24h内NF-κB的强烈激活可能是神经自身的一种保护性防御反应，保护神经元抗凋亡，有利于神经的再生，而72h后NF-κB的持久激活可能引起神经元的凋亡甚至迟发性死亡，与Salminen等[6]的研究结果基本一致；③DC组48h后NF-κB在低水平表达且持续下降，提示其炎症反应较轻，去大骨瓣减压可能间接通过降低NF-κB表达继而减轻炎症反应，减轻二次脑损伤。
参考文献
[1] Feuerstein GZ，Liu T，Barone FC.Cytokines，inflammation，and brain injury：role of tumor necrosis factor-alpha[J].Cerebrovasc Brain Metab Rev，1994，6（4）：341-360.
[2] Sen R，Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences.Cell，1986，46（5）：705-716.
[3] Nimmo AJ，Cernak I，Heath DL，et al.Neurogenic inflammation is associated with development of edema and functional deficits following traumatic brain injury in rats.Neuropeptides，2004，38（1）：40-47.
[4] Nonaka M，Chen XH，Pierce JE，et al.Prolonged activation of NF-kappaB following traumatic brain injury in rats.J Neurotrauma，1999，16（11）：1023-1034.
[5] Carroll JE，Howard EF，Hess DC，et al.Nuclear factor-kappa B activation during cerebral reperfusion：effect of attenuation with N-acetylcysteine treatment.Brain Res Mol Brain Res，1998，56（1-2）：186-191.
[6] Read MA，Whitley MZ，Williams AJ，et al.NF-kappa B and I kappa B alpha：an inducible regulatory system in endothelial activation.J Exp Med，1994，179（2）：503-512.
【关键词】 去大骨瓣减压；重型颅脑损伤；NF-κB
文章编号：1004-7484（2013）-02-0555-02
创伤性脑损伤是世界性的多发性疾病，也是死亡率和致残率最高的疾病之一。研究认为NF-κB的活化是引发脑外伤后继发性生化级联反应的关键步骤，在创伤性脑水肿的病理生理发生发展过程中有着重要的作用[1]。本研究通过比较去大骨瓣减压组和非去大骨瓣减压组大鼠重型脑损伤后NF-κB的表达，拟探讨NF-κB在去大骨瓣减压的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组 SPF级成年SD大鼠90只，雌雄不限，体重250-350g，由汕头大学医学院实验动物中心提供。随机分为假手术组（简称SH组，6只），非去大骨瓣减压组（简称NDC组，42只）和去大骨瓣减压组（简称DC组，42只）（打击后6h、12h、24h、48h、72h、120h和168h各6只）。如果有死亡，则选择备用大鼠重新造模，补充至预定样本数。
1.2 模型的建立 动物模型采用改良Feeney's自由落体脑损伤装置制成。实验大鼠经2%戊巴比妥钠（45mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，头顶正中稍偏右纵行切开头皮约2.0cm，剥离骨膜，暴露右顶骨，用微型颅钻在冠状缝后1.5mm，中线旁2.0mm处钻一直径5.0mm骨窗，保持硬膜完整。将撞击圆锥置于硬膜上，用40g砝码于25cm高处沿空心导管坠落，通过撞击圆锥间接撞击硬膜，致右顶叶重型脑挫裂伤，打击后计时。NDC组大鼠止血后骨蜡封闭骨窗，缝合头皮；DC组同时行去大骨瓣减压术，形成大小约0.8cm×1.0cm减压骨窗，放射状剪开硬膜，止血后缝合头皮；SH组仅钻孔，不打击。
1.3 标本处理 各时间点每组6只大鼠过量麻醉后快速断头取脑，在冰盘上切取脑挫裂伤灶脑组织块，迅速用4%多聚甲醛液固定24h后常规脱水、石蜡包埋，每个标本切片厚度5um，用于NF-κB和免疫组化染色。
1.4 免疫组化染色及阳性细胞计数 采用链霉素亲和素—生物素—过氧化酶复合物法（SABC法），参照试剂盒说明书进行染色，一抗为NFκB p65（F-6）（浓度为1：50，购自美国SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC），使用已知阳性切片做阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗进行免疫组化染色。
每张切片随机选取10个不重复视野（各组所选部位尽可能相同），在高倍（10×40）镜下观察（相同条件），运用HMIAS-2000高清晰度图像采集处理系统采图。采用直接计数法计算每个视野下阳性细胞数目，取其均值表示各切片的测定结果。
1.5 数据处理 结果以 表示，用SPSS13.0 for Windows及Excel 软件进行统计处理。多组间均数的两两比较采用单因素方差分析，显著性水平为0.05。
2 结果
胞浆和（或）胞核有颗粒状及条索状棕黄色沉淀为NF-κB阳性表达的细胞，不仅分布在血脑屏障的内皮细胞上，还可出现在神经元、神经胶质细胞、脑室壁和脉络丛的细胞上以及血管壁平滑肌细胞上，以内皮细胞表達为主、其次是星型胶质细胞。
假手术组无明显阳性表达，在损伤组各时间点均有NF-κB阳性表达的细胞，但阳性细胞数呈现一个动态的变化过程。脑损伤后6h在损伤灶及其周围皮质即有多量的NF-κB阳性细胞；脑损伤后12h阳性细胞数继续增加；脑损伤后24h，损伤区及其周围NF-κB阳性细胞数量明显增加，达到高峰，然后迅速下降；脑损伤后48h-168hNF-κB阳性细胞数逐渐下降。NDC组与DC组变化曲线相似，但NDC组在每个时间点的阳性细胞数均高于DC组，其中在24h、72h及168h差异有高度显著性（P<0.01），120h差异有显著性（P<0.05），但48h差异无显著性，见表1，图1、2。
3 讨论
标准外伤大骨瓣开颅术在临床上应用已三十多年，其基础与临床研究均取得了较大进步，但目前国内外在分子水平上的实验研究较少。随着医学分子生物学、免疫学、神经生物学的飞速发展，目前对脑损伤的研究已经深入到亚细胞及分子水平。NF-κB是在1986年由Sen和Baltimore[2]应用凝胶电泳迁移率实验（EMSA）分析B细胞核提取物中发现的，因参与B细胞κ轻链的表达调控而得名。NF-κB是一组真核细胞转录因子，由NF-κB/Rel蛋白家族成员NF-κB1（p50，其前体p105），NF-κB2（p52，其前体p100），RelA（p65），RelB和C-Rel以同源或异源二聚体。
近年来发现NF-κB在神经系统中广泛表达，是与脑损伤后脑组织中免疫应答反应密切相关的细胞因子，它与神经系统许多生理、病理生理活动密切相关。
越来越多的研究显示脑炎性反应在颅脑外伤后的继发性脑损伤中发挥着重要作用[3]。近年对炎症本质的研究取得了较大进展，即发现炎症的发生主要与核转录因子，特别是NF-κB有关，NF-κB的活化是引发脑外伤继发性生化级联反应的关键步骤，在TBE病理生理的发生发展过程中有着重要的作用[1]。 在目前的神經损伤模型中，无论是中枢神经还是周围神经损伤，均可见NF-κB的激活。研究认为NF-κB存在于神经系统几乎所有类型的细胞中，主要包括神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞、少突细胞和神经干细胞，甚至在突触上也发现了NF-κB的定位。但本研究发现：NF-κB表达较强的位置主要在血管内皮细胞，其次是神经胶质细胞；脑损伤后6h脑组织NF-κB活性即增高，并逐渐增强，于伤后24h达高峰后迅速下降，Nonaka等[4]报道，在创伤性脑损伤大鼠中大脑皮层NF-κB活性在伤后数小时内显著增高，并至少持续24h维持在高水平状态，与我们的研究结果相符。48h-168h逐渐下降；NDC组与DC组变化曲线相似，但NDC组在每个时间点的阳性细胞数均高于DC组，其中在24h、72h及168h差异有高度显著性（P<0.01），120h差异有显著性（P<0.05），但48h差异无显著性。
研究认为NF-κB在内皮细胞，尤其是在炎症反应时的内皮细胞中起“枢纽”作用[5]。脑损伤后早期NF-κBp65在血管内皮细胞和神经胶质细胞中即可被激活，提示NF-κB在调控自由落体脑损伤后的多个病理生理过程中，这两类细胞可能起主要作用；内皮细胞激活是炎症反应的关键步骤，炎性损伤起初发生在脑的微血管内皮细胞和神经胶质细胞，随即累及周围的神经组织。因此我们推测：①脑损伤后NF-κBp65可早期被激活，NF-κB在调控TBI后多个病理生理过程中，血管内皮细胞和神经胶质细胞可能起着更为重要的作用，内皮细胞激活是炎症反应的关键步骤，炎性损伤最初发生在脑的微血管内皮细胞，随即累及周围的神经组织，激活的内皮细胞在转录因子，特别是在NF-κB系统的调节下，介导或直接参与白细胞与血管内皮细胞的相互作用以及血管和组织的损伤；②损伤24h内NF-κB的强烈激活可能是神经自身的一种保护性防御反应，保护神经元抗凋亡，有利于神经的再生，而72h后NF-κB的持久激活可能引起神经元的凋亡甚至迟发性死亡，与Salminen等[6]的研究结果基本一致；③DC组48h后NF-κB在低水平表达且持续下降，提示其炎症反应较轻，去大骨瓣减压可能间接通过降低NF-κB表达继而减轻炎症反应，减轻二次脑损伤。
参考文献
[1] Feuerstein GZ，Liu T，Barone FC.Cytokines，inflammation，and brain injury：role of tumor necrosis factor-alpha[J].Cerebrovasc Brain Metab Rev，1994，6（4）：341-360.
[2] Sen R，Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences.Cell，1986，46（5）：705-716.
[3] Nimmo AJ，Cernak I，Heath DL，et al.Neurogenic inflammation is associated with development of edema and functional deficits following traumatic brain injury in rats.Neuropeptides，2004，38（1）：40-47.
[4] Nonaka M，Chen XH，Pierce JE，et al.Prolonged activation of NF-kappaB following traumatic brain injury in rats.J Neurotrauma，1999，16（11）：1023-1034.
[5] Carroll JE，Howard EF，Hess DC，et al.Nuclear factor-kappa B activation during cerebral reperfusion：effect of attenuation with N-acetylcysteine treatment.Brain Res Mol Brain Res，1998，56（1-2）：186-191.
[6] Read MA，Whitley MZ，Williams AJ，et al.NF-kappa B and I kappa B alpha：an inducible regulatory system in endothelial activation.J Exp Med，1994，179（2）：503-512.