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[摘要] 目的 探讨急性早幼粒细胞白血病患者早期死亡危险因素。 方法 分析我院42例APL患者发病时的白细胞计数、血小板计数、纤维蛋白原含量等特点，并比较APL患者的免疫分型、融合基因及基因突变等因素。 结果 42例APL患者中，6例出现早期死亡，早期死亡率14.3%。其中4例死于脑出血，1例死于弥漫性血管内凝血并多脏器功能衰竭，1例死于心肌梗死。死亡组患者白细胞计数显著高于完全缓解组，血小板及纤维蛋白原计数均较完全缓解组患者低，5例为CD2 ，5例为CD34和（或）HLA-DR ，4例存在FT3-ITD基因突变，与完全缓解组比较差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 高白细胞血症、低血小板计数、低纤维蛋白原、CD2 、CD34和（或）HLA-DR 、FT3-ITD基因突变的急性早幼粒细胞白血病患者早期死亡率高。
[关键词] 急性早幼粒细胞白血病；早期死亡；免疫表型；融合基因；基因突变
[中图分类号] R733.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）16-0015-03
[Abstract] Objective To investigate risk factors for early death in acute promyelocytic leukemia patients. Methods The clinical characteristics including leucocyte counts at onset，platelet count and fibrinogen content of 42 patients with APL were evaluated. The factors of immunophenotype， genes fusion as well as gene mutations were compared. Results Among the 42 patients with APL， 6 cases were observed early death with the early mortality rate of 14.3%. To be specific， 4 deaths were attributable to cerebral hemorrhage， whereas the other two were linked with disseminated intravascular coagulation complicated with multiple organ failure and myocardial infarction respectively. The leukocyte counts of dead patients were significantly more than complete remission group. At the same time， the blood platelet counts and the fibrinogen counts were all less than those of complete remission patients. 5 patients were confirmed as CD2 ， 5 cases were CD34 and/or HLA-DR ， and FLT3-ITD gene mutation was found in 4 subjects. Difference between the two groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion Acute promyelocytic leukemia patients with leukocytosis， low platelet count， hypofibrinogenemia， CD2 ， CD34 and/or HLA-DR as well as FLT3-ITD gene mutation are at an increased risk of early death in the risk factor analysis.
[Key words] Acute promyelocytic leukemia； Early death； Immunophenotype； Fusiongene； Gene mutations
急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leu-kemia，APL）是急性髓系白血病的特殊类型，大量的白细胞分化停滞在早幼粒阶段，大多数患者存在染色体 t（15；17）（q22；q12）易位形成的PML/RARα融合基因[1]，其发病率占急性白血病的6%～9%，临床上易并发凝血功能障碍为其突出特点，起病凶险，早期死亡率高[2]。维甲酸、亚砷酸相继应用于临床，其中亚砷酸被认为是治疗急性早幼粒细胞白血病的所有阶段的有效药物，包括缓解、复发病例[3，4]，APL的完全缓解率升至90%以上，大部分患者不需要异基因造血干细胞移植，即可达到长期生存，但仍有少部分患者出现早期死亡。伴随检查手段的不断完善，细胞形态学、免疫学、分子生物学及细胞遗传学等方面的相关检查，进一步对APL的诊断及判断预后提供了有力证据。我院收治APL患者42例，其中6例早期死亡，现将其相关危险因素分析报道如下。
1 对象与方法
1.1研究对象
我院2010年8月～2014年12月确诊APL患者共42例，早期死亡6例，其中男4例，女2例，年龄18～66岁，中位年龄42岁。APL诊断根据临床表现、血象、骨髓象、免疫组化、流式细胞免疫分型、PML/RARα融合基因、染色体确诊，其中24例检测FLT3-ITD突变，包括6例死亡患者。 1.2 治疗方案
患者确诊后均给予三联方案诱导治疗（维甲酸 20 mg/（m2·d）口服至血液学完全缓解；亚砷酸 0.16 mg/（kg·d），静脉滴注至血液学完全缓解；柔红霉素 40 mg/m2·d，d4～6或去甲氧柔红霉素 8 mg/（m2·d），d4～6静脉滴注）。临床凝血功能障碍患者输注血小板、冷沉淀、新鲜冰冻血浆，维持纤维蛋白原>1.0 g/L，同时加用小剂量低分子肝素钙抗凝治疗。
1.3疗效评价
APL患者诱导治疗骨髓评价一般在第4～6周、血细胞计数恢复后进行，评价标准参见文献[5]。
1.4免疫表型分析
抽取肝素抗凝的骨髓，采用流式细胞术免疫荧光标记法，对42例患者进行免疫表型分析。检测抗原：CD2、CD3、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD33、CD34、CD117、HLA-DR、CD45。每次至少分析1×106个白细胞。采用FC500流式细胞分析仪，MXP/CXP检测软件， FCS EXPRESS分析软件。首先通过CD45/SSC设门识别白血病细胞群，再分析该细胞群各抗原的表达情况，分析时以异常细胞群中抗原表达>20%作为该指标阳性，而CD34则以>10%作为阳性判断标准[6]。
1.5 PML-RARα融合基因
采集EDTA抗凝的骨髓液2 mL，4℃保存，SYBR Green Ⅰ染料法制备标本，在T personal 型BIOMETRA PCR仪上同时检测 PML/RARα和内参基因ABL表达。以ABL基因监测 RQ-RT-PCR 扩增的模板质量， 用 PML/RARα基因的两对引物，分别扩增 L 型（上游引物GGA GCC CCG TCA TAG GAA GT；下游引物GG GCT GGG CAC TAT CTC TTC）和S型（上游引物CCG ATG GCT TCG ACG AGT T；下游引物GG GCT GGG CAC TAT CTC TT）两个不同的转录剪接本。并以重组质粒ABL标准品原液作梯度稀释（1×10）～（1×1010）个数量级范围，做为标准曲线[7]。
1.6 FLT3-ITD突变
采集患者骨髓2 mL，抽提总DNA。测定吸光度A260 nm/A280 nm值，确定DNA的纯度及浓度，并以去离子水稀释DNA样本，PCR扩增（引物序列：上游引物GCA ATT TAG GTA TGA AAG CCA CG；下游引物CTT TCA GCA TTT TGA CGG CAA CC），通过琼脂糖凝胶电泳，观察成像结果[8，9]。
1.7统计学方法
采用 SPSS 17.0统计学软件，计量资料以（x±s）表示，采用成组t检验，计数资料采用χ2检验，双侧检验。α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 死亡组和完全缓解组血常规及凝血结果比较
6例死亡患者（死亡组），其中4例死于脑出血，1例于治疗开始前即已出现脑出血死亡，余3例于诱导治疗过程中并发脑出血死亡，1例于诱导治疗第10天出现DIC并多脏器功能衰竭死亡，1例死于心肌梗死。其余36例设为完全缓解组，死亡组初诊时均为高白细胞血症患者，血小板计数及纤维蛋白原计数显著低于正常范围，与完全缓解组比较，差异有统计学意义（P均<0.05）。见表1。
2.2死亡组和完全缓解组免疫分型、融合基因及基因突变结果比较
死亡组中检测到5例CD2阳性，5例为CD34和（或）HLA-DR阳性，4例FLT3-ITD基因突变阳性，与完全缓解组患者比较，差异有统计学意义（P<0.05）。死亡组PML/RARα融合基因L型/S型比例与完全缓解组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
3 讨论
伴随全反式维甲酸及亚砷酸应用于临床，急性早幼粒细胞白血病的诱导缓解率及长期生存率大幅提高，但仍是急性白血病当中早期最为凶险的类型，相当一部分患者死于本病所诱发的凝血功能障碍，受到人们的广泛关注[10，11]。本组6例死亡患者均死于凝血功能障碍的不同阶段，故有效缩短凝血功能障碍时间就成为降低死亡率的关键。部分专家认为单用维甲酸即可达到诱导分化的目的，亚砷酸仅用于复发难治患者，但亚砷酸具有诱导分化及促进凋亡的双重功效，对于控制白细胞升高及缩短凝血功能障碍的持续时间均起到积极作用，亦适用于初诊患者[12]。有学者提出非高危患者仅口服复方黄黛片和维甲酸，即可获得完全缓解，避免了细胞毒性药物所产生的副作用[13，14]，但准确区分出低危与高危患者就显得更为关键。此外，合理有效的辅助治疗同样重要，积极输注冷沉淀、血小板并给以小剂量低分子肝素等措施为诱导缓解赢得了宝贵时间[15]。通过上述42例初诊急性早幼粒细胞白血病患者病例分析，高白细胞血症、低血小板计数、低纤维蛋白原、流式细胞仪检测CD2 阳性、CD34和（或）HLA-DR阳性及FLT3-ITD基因突变阳性患者死亡率偏高，可作为临床更为密切关注的对象。故对于初诊APL患者，怎样有效区分出低危与高危患者，分层治疗，在降低药物副作用的同时达到最佳疗效，成为临床医生研究的重点。
[参考文献]
[1] De Thé H，Le Bras M，Lallemand-Breitenbach V. The cell biology of disease：Acute promyelocytic leukemia，arsenic，and PML bodies[J]. J Cell Biol，2012，198（1）：11-21.
[2] Zhu G. Novel treatment of acute promyelocytic leukemia：As2O3，retinoic acid and retinoid pharmacology[J]. Curr Pharm Biotechnol，2013，14（9）：849-858. [3] Zhu HH，Wu DP，Jin J，et al. Oral tetra-arsenic tetra-sulfide formula versus intravenous arsenic trioxide as first-line treatment of acute promyelocytic leukemia：A multicenter randomized controlled trial[J]. J Cell Biol，2013，31（33）：4215-4221.
[4] Chendamarai E，Ganesan S，Alex AA，et al. Comparison of newly diagnosed and relapsed patients with acute promyelocytic leukemia treated with arsenic trioxide：Insight into mechanisms of resistance[J]. PLoS Onel，2015，10（3）：e0121912.
[5] 张之南，沈悌. 血液病诊断及疗效标准[M]. 第3版. 北京：科学出版社，2007：106-115.
[6] 谢若腾，林萍，骆云龙，等. 流式细胞术在检测急性早幼粒细胞白血病微量残存病中的应用[J]. 福建医药杂志，2014，3（36）：75-78.
[7] 康志杰，崔嵩，李莉，等. 急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因筛查及实时定量检测平台的建立[J]. 现代肿瘤医学，2014，22（7）：1522-1526.
[8] 徐媛媛，高丽，丁一，等. 急性髓系白血病中FLT3-ITD 基因突变的检测及其临床意义[J]. 中国实验血液学杂志，2012，20（6）：1312-1315.
[9] 尹佳，孙爱宁，田孝鹏，等. 急性早幼粒细胞白血病中常见白血病基因突变的检测及其临床意义[J]. 中国实验血液学杂志，2013，21（1）：39-44.
[10] Houry Leblebjian，Daniel J DeAngelo，J Andrew Skirvin，et al. Predictive factors for all-trans retinoic acid-related differentiation syndrome in patients with acute promyelocytic leukemia[J]. Leukemia Research，2013，37（7）：747-751.
[11] Ikezoe T. Pathogenesis of disseminated intravascular coagulation in patients with acute promyclocytic leukemia and its treatment using recombinant human soluble thrombomodulin[J]. Int J Hematol，2014，100（1）：27-37.
[12] Alimoghaddam K. A review of arsenic trioxide and acute promyelocytic leukemia[J]. Int J Hematol Oncol Stem Cell Res，2014，8（3）：44-54.
[13] Zhu HH，Huang XJ. Oral arsenic and retinoic acid for non-high-risk acute promyelocytic leukemia[J]. New England Journal of Medicine，2014，371（23）：2239-2241.
[14] Lo-Coco F，Cicconi L. Outpatient oral treatment for acute promyelocytic leukemia[J]. N Engl J Med，2015，372（9）：885.
[15] 杨华，朱成英，王全顺，等. 初治急性早幼粒细胞白血病合并弥散性血管内凝血经验性治疗分析[J]. 中华实验血液学杂志，2014，22（2）：315-322.
（收稿日期：2015-04-08）
[关键词] 急性早幼粒细胞白血病；早期死亡；免疫表型；融合基因；基因突变
[中图分类号] R733.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）16-0015-03
[Abstract] Objective To investigate risk factors for early death in acute promyelocytic leukemia patients. Methods The clinical characteristics including leucocyte counts at onset，platelet count and fibrinogen content of 42 patients with APL were evaluated. The factors of immunophenotype， genes fusion as well as gene mutations were compared. Results Among the 42 patients with APL， 6 cases were observed early death with the early mortality rate of 14.3%. To be specific， 4 deaths were attributable to cerebral hemorrhage， whereas the other two were linked with disseminated intravascular coagulation complicated with multiple organ failure and myocardial infarction respectively. The leukocyte counts of dead patients were significantly more than complete remission group. At the same time， the blood platelet counts and the fibrinogen counts were all less than those of complete remission patients. 5 patients were confirmed as CD2 ， 5 cases were CD34 and/or HLA-DR ， and FLT3-ITD gene mutation was found in 4 subjects. Difference between the two groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion Acute promyelocytic leukemia patients with leukocytosis， low platelet count， hypofibrinogenemia， CD2 ， CD34 and/or HLA-DR as well as FLT3-ITD gene mutation are at an increased risk of early death in the risk factor analysis.
[Key words] Acute promyelocytic leukemia； Early death； Immunophenotype； Fusiongene； Gene mutations
急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leu-kemia，APL）是急性髓系白血病的特殊类型，大量的白细胞分化停滞在早幼粒阶段，大多数患者存在染色体 t（15；17）（q22；q12）易位形成的PML/RARα融合基因[1]，其发病率占急性白血病的6%～9%，临床上易并发凝血功能障碍为其突出特点，起病凶险，早期死亡率高[2]。维甲酸、亚砷酸相继应用于临床，其中亚砷酸被认为是治疗急性早幼粒细胞白血病的所有阶段的有效药物，包括缓解、复发病例[3，4]，APL的完全缓解率升至90%以上，大部分患者不需要异基因造血干细胞移植，即可达到长期生存，但仍有少部分患者出现早期死亡。伴随检查手段的不断完善，细胞形态学、免疫学、分子生物学及细胞遗传学等方面的相关检查，进一步对APL的诊断及判断预后提供了有力证据。我院收治APL患者42例，其中6例早期死亡，现将其相关危险因素分析报道如下。
1 对象与方法
1.1研究对象
我院2010年8月～2014年12月确诊APL患者共42例，早期死亡6例，其中男4例，女2例，年龄18～66岁，中位年龄42岁。APL诊断根据临床表现、血象、骨髓象、免疫组化、流式细胞免疫分型、PML/RARα融合基因、染色体确诊，其中24例检测FLT3-ITD突变，包括6例死亡患者。 1.2 治疗方案
患者确诊后均给予三联方案诱导治疗（维甲酸 20 mg/（m2·d）口服至血液学完全缓解；亚砷酸 0.16 mg/（kg·d），静脉滴注至血液学完全缓解；柔红霉素 40 mg/m2·d，d4～6或去甲氧柔红霉素 8 mg/（m2·d），d4～6静脉滴注）。临床凝血功能障碍患者输注血小板、冷沉淀、新鲜冰冻血浆，维持纤维蛋白原>1.0 g/L，同时加用小剂量低分子肝素钙抗凝治疗。
1.3疗效评价
APL患者诱导治疗骨髓评价一般在第4～6周、血细胞计数恢复后进行，评价标准参见文献[5]。
1.4免疫表型分析
抽取肝素抗凝的骨髓，采用流式细胞术免疫荧光标记法，对42例患者进行免疫表型分析。检测抗原：CD2、CD3、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD33、CD34、CD117、HLA-DR、CD45。每次至少分析1×106个白细胞。采用FC500流式细胞分析仪，MXP/CXP检测软件， FCS EXPRESS分析软件。首先通过CD45/SSC设门识别白血病细胞群，再分析该细胞群各抗原的表达情况，分析时以异常细胞群中抗原表达>20%作为该指标阳性，而CD34则以>10%作为阳性判断标准[6]。
1.5 PML-RARα融合基因
采集EDTA抗凝的骨髓液2 mL，4℃保存，SYBR Green Ⅰ染料法制备标本，在T personal 型BIOMETRA PCR仪上同时检测 PML/RARα和内参基因ABL表达。以ABL基因监测 RQ-RT-PCR 扩增的模板质量， 用 PML/RARα基因的两对引物，分别扩增 L 型（上游引物GGA GCC CCG TCA TAG GAA GT；下游引物GG GCT GGG CAC TAT CTC TTC）和S型（上游引物CCG ATG GCT TCG ACG AGT T；下游引物GG GCT GGG CAC TAT CTC TT）两个不同的转录剪接本。并以重组质粒ABL标准品原液作梯度稀释（1×10）～（1×1010）个数量级范围，做为标准曲线[7]。
1.6 FLT3-ITD突变
采集患者骨髓2 mL，抽提总DNA。测定吸光度A260 nm/A280 nm值，确定DNA的纯度及浓度，并以去离子水稀释DNA样本，PCR扩增（引物序列：上游引物GCA ATT TAG GTA TGA AAG CCA CG；下游引物CTT TCA GCA TTT TGA CGG CAA CC），通过琼脂糖凝胶电泳，观察成像结果[8，9]。
1.7统计学方法
采用 SPSS 17.0统计学软件，计量资料以（x±s）表示，采用成组t检验，计数资料采用χ2检验，双侧检验。α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 死亡组和完全缓解组血常规及凝血结果比较
6例死亡患者（死亡组），其中4例死于脑出血，1例于治疗开始前即已出现脑出血死亡，余3例于诱导治疗过程中并发脑出血死亡，1例于诱导治疗第10天出现DIC并多脏器功能衰竭死亡，1例死于心肌梗死。其余36例设为完全缓解组，死亡组初诊时均为高白细胞血症患者，血小板计数及纤维蛋白原计数显著低于正常范围，与完全缓解组比较，差异有统计学意义（P均<0.05）。见表1。
2.2死亡组和完全缓解组免疫分型、融合基因及基因突变结果比较
死亡组中检测到5例CD2阳性，5例为CD34和（或）HLA-DR阳性，4例FLT3-ITD基因突变阳性，与完全缓解组患者比较，差异有统计学意义（P<0.05）。死亡组PML/RARα融合基因L型/S型比例与完全缓解组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
3 讨论
伴随全反式维甲酸及亚砷酸应用于临床，急性早幼粒细胞白血病的诱导缓解率及长期生存率大幅提高，但仍是急性白血病当中早期最为凶险的类型，相当一部分患者死于本病所诱发的凝血功能障碍，受到人们的广泛关注[10，11]。本组6例死亡患者均死于凝血功能障碍的不同阶段，故有效缩短凝血功能障碍时间就成为降低死亡率的关键。部分专家认为单用维甲酸即可达到诱导分化的目的，亚砷酸仅用于复发难治患者，但亚砷酸具有诱导分化及促进凋亡的双重功效，对于控制白细胞升高及缩短凝血功能障碍的持续时间均起到积极作用，亦适用于初诊患者[12]。有学者提出非高危患者仅口服复方黄黛片和维甲酸，即可获得完全缓解，避免了细胞毒性药物所产生的副作用[13，14]，但准确区分出低危与高危患者就显得更为关键。此外，合理有效的辅助治疗同样重要，积极输注冷沉淀、血小板并给以小剂量低分子肝素等措施为诱导缓解赢得了宝贵时间[15]。通过上述42例初诊急性早幼粒细胞白血病患者病例分析，高白细胞血症、低血小板计数、低纤维蛋白原、流式细胞仪检测CD2 阳性、CD34和（或）HLA-DR阳性及FLT3-ITD基因突变阳性患者死亡率偏高，可作为临床更为密切关注的对象。故对于初诊APL患者，怎样有效区分出低危与高危患者，分层治疗，在降低药物副作用的同时达到最佳疗效，成为临床医生研究的重点。
[参考文献]
[1] De Thé H，Le Bras M，Lallemand-Breitenbach V. The cell biology of disease：Acute promyelocytic leukemia，arsenic，and PML bodies[J]. J Cell Biol，2012，198（1）：11-21.
[2] Zhu G. Novel treatment of acute promyelocytic leukemia：As2O3，retinoic acid and retinoid pharmacology[J]. Curr Pharm Biotechnol，2013，14（9）：849-858. [3] Zhu HH，Wu DP，Jin J，et al. Oral tetra-arsenic tetra-sulfide formula versus intravenous arsenic trioxide as first-line treatment of acute promyelocytic leukemia：A multicenter randomized controlled trial[J]. J Cell Biol，2013，31（33）：4215-4221.
[4] Chendamarai E，Ganesan S，Alex AA，et al. Comparison of newly diagnosed and relapsed patients with acute promyelocytic leukemia treated with arsenic trioxide：Insight into mechanisms of resistance[J]. PLoS Onel，2015，10（3）：e0121912.
[5] 张之南，沈悌. 血液病诊断及疗效标准[M]. 第3版. 北京：科学出版社，2007：106-115.
[6] 谢若腾，林萍，骆云龙，等. 流式细胞术在检测急性早幼粒细胞白血病微量残存病中的应用[J]. 福建医药杂志，2014，3（36）：75-78.
[7] 康志杰，崔嵩，李莉，等. 急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因筛查及实时定量检测平台的建立[J]. 现代肿瘤医学，2014，22（7）：1522-1526.
[8] 徐媛媛，高丽，丁一，等. 急性髓系白血病中FLT3-ITD 基因突变的检测及其临床意义[J]. 中国实验血液学杂志，2012，20（6）：1312-1315.
[9] 尹佳，孙爱宁，田孝鹏，等. 急性早幼粒细胞白血病中常见白血病基因突变的检测及其临床意义[J]. 中国实验血液学杂志，2013，21（1）：39-44.
[10] Houry Leblebjian，Daniel J DeAngelo，J Andrew Skirvin，et al. Predictive factors for all-trans retinoic acid-related differentiation syndrome in patients with acute promyelocytic leukemia[J]. Leukemia Research，2013，37（7）：747-751.
[11] Ikezoe T. Pathogenesis of disseminated intravascular coagulation in patients with acute promyclocytic leukemia and its treatment using recombinant human soluble thrombomodulin[J]. Int J Hematol，2014，100（1）：27-37.
[12] Alimoghaddam K. A review of arsenic trioxide and acute promyelocytic leukemia[J]. Int J Hematol Oncol Stem Cell Res，2014，8（3）：44-54.
[13] Zhu HH，Huang XJ. Oral arsenic and retinoic acid for non-high-risk acute promyelocytic leukemia[J]. New England Journal of Medicine，2014，371（23）：2239-2241.
[14] Lo-Coco F，Cicconi L. Outpatient oral treatment for acute promyelocytic leukemia[J]. N Engl J Med，2015，372（9）：885.
[15] 杨华，朱成英，王全顺，等. 初治急性早幼粒细胞白血病合并弥散性血管内凝血经验性治疗分析[J]. 中华实验血液学杂志，2014，22（2）：315-322.
（收稿日期：2015-04-08）