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摘要：为了确定喜马拉雅紫茉莉的最佳采收年限和采收时期，采用HPLC法研究了不同生长年限的喜马拉雅紫茉莉营养器官的生物量、鱼藤酮类化合物boeravinone C（R1）总量及其分布的动态变化。结果表明：林芝地区喜马拉雅紫茉莉的最佳采收年限为2年，最佳采收时期是9月中旬；喜马拉雅紫茉莉的根、茎、叶等营养器官中都含有R1，从而在一定程度上扩大了其药源，可以在一定程度上缓解喜马拉雅紫茉莉根产量的不足。
关键词：喜马拉雅紫茉莉；营养器官；鱼藤酮类化合物；HPLC；动态变化
中图分类号：S567.230.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0255-03
收稿日期：2013-10-26
基金项目：国家科技支撑计划（编号：2011BAI13B06）；第四次全国中药资源普查项目（编号：20120716-540000）；西藏自治区科技厅重大专项（编号：2011-68-20）。
作者简介：李连强（1981—），男，云南弥渡人，硕士，讲师，主要从事生物技术、濒危藏药材人工种植与示范的研究。E-mail：tibetfred@163.com。
通信作者：兰小中，副教授，主要从事药用植物资源教学与研究工作。E-mail：lanxiaozhong@163.com。喜马拉雅紫茉莉常指紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉[Mirabilis himalaica （Edgew.） Heimerl]的根[1]，藏语名为巴朱，具有温肾、益肾滋补、生肌、利尿、排石等功效，临床上主要用于治疗胃寒、肾寒、下身寒、阳萎浮肿等[2]。喜马拉雅紫茉莉是十余个具有国药准字号的藏药产品的主要原料之一，年需求量约500 t左右[3]，随着喜马拉雅紫茉莉制剂品种的不断增多，喜马拉雅紫茉莉药材的需求量急剧上升。笔者所在课题组通过近3年的调查发现，野生的喜马拉雅紫茉莉基本上以杂草的形式零星分布于西藏林芝、昌都、山南地区和拉萨市的田间地头，严重限制了以喜马拉雅紫茉莉为原料的藏药产业的发展。经过近6年的不断摸索，笔者所在课题组已经系统掌握了喜马拉雅紫茉莉的人工种植关键技术，提高了喜马拉雅紫茉莉的产量，改善了野生喜马拉雅紫茉莉资源匮乏的现状。但是喜马拉雅紫茉莉的传统藥用部位是根，其茎叶通常被人们弃之不用，若将其地上部位全部入药，其药源将明显扩大。
范海霞综合应用硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备HPLC 等技术，从喜马拉雅紫茉莉根中分离得到了一种鱼藤酮类化合物（rotenoids）-boeravinone C（以下简称R1），并证实R1对多种癌细胞株都有较强的抑制作用[4]，表明R1可能是喜马拉雅紫茉莉的主要活性成分之一。本研究表明，喜马拉雅紫茉莉的根、茎、叶等营养器官中均含有R1；本研究用HPLC法对笔者所在课题组在西藏林芝地区的西藏大学农牧学院动物科学学院实习基地人工种植的1年生、2年生、3年生喜马拉雅紫茉莉根、茎、叶中的R1总量及其所占比例的动态变化进行研究，以期为扩大藏药巴朱的药源提供参考依据。
1材料与方法
1.1仪器与试药
岛津LC-20高效液相色谱仪（A泵：LC-20AD、B泵：LC-20AD、DGU-20A3R在线脱气、SIL-20A自动进样器、柱温箱、SPD-20A紫外检测器）；Mettler toledo PL203分析天平；Mettler toledo B-S天平；BUCHI B-491旋转蒸发器；KQ5200型超声波清洗仪；BL-200型高速多功能粉碎机。
R1对照品由西南大学药学院的陈敏教授实验室自制，用HPLC色谱归一法测定纯度> 98%；甲醇为色谱纯；试验用水为“娃哈哈”纯净水，均经0.45 μm滤膜滤过。
1.2试验方法
1.2.1样品的采集与处理1、2、3年生喜马拉雅紫茉莉的根、茎、叶样品采自西藏大学农牧学院动物科学学院的实习基地，经西藏大学农牧学院罗建副研究员鉴定为紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉[M.himalaica （Edgew.）Heimerl]，鉴定后保存于西藏大学农牧学院的分子生物学实验室内。采样时间为2012年7至10月，每月15日左右采样，共采样4次。1、2、3年生的喜马拉雅紫茉莉分别平行采样4株。将喜马拉雅紫茉莉植株采挖后带回分子生物学实验室，洗净泥沙后分成根、茎、叶3个部分，置于105 ℃烘箱中杀青15 min后，60 ℃烘干至恒重。将同一次采收的1、2、3年生的根、茎、叶样品粉碎后分别混合，过100目筛，备用。
1.2.2色谱条件Kromosil 100-5 C18柱（150×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（70 ∶30）；流速0.8 mL/min；检测波长294 nm，柱温25 ℃。
1.2.3对照品及样品溶液的制备
1.2.3.1对照品溶液的制备精确称取4.05 mg烘干至恒重的R1对照品，用色谱纯甲醇定容至25 mL即得浓度为0162 mg/mL的R1对照品母液。取1 mL R1对照品母液，用色谱纯甲醇定容至5 mL即得浓度为0.0324 mg/mL的R1对照品溶液。
1.2.3.2R1标准曲线的绘制取浓度为0.032 4 mg/mL的R1对照品溶液，分别进样1、3、5、7、9、12、15 μL（n=3），测定其峰面积。
1.2.3.3样品溶液的制备精确称取1.000 g左右样品，加入20 mL甲醇浸泡数分钟，超声提取2次，每次30 min，滤过；合并滤液，滤液用旋转蒸发仪蒸干后用甲醇定容至2 mL，经0.45 μm滤膜滤过，滤液作为样品溶液。
1.2.4样品中R1含量测定取5 μL上述样品溶液，测定其峰面积。根据峰面积，由线性回归方程计算R1的含量。
3结论
R1对多种癌细胞株都有较强的抑制作用，表明R1可能是喜马拉雅紫茉莉的主要活性成分之一。喜马拉雅紫茉莉的传统药用部位是根，其茎叶可弃之不用，本研究采用HPLC法初步证实，喜马拉雅紫茉莉的根、茎、叶等营养器官中都含有R1，其药源将明显扩大，可以从一定程度上缓解喜马拉雅紫茉莉根产量的不足。在此基础上，本研究以1、2、3年生的喜马拉雅紫茉莉为材料，采用HPLC法研究了不同采收期对喜马拉雅紫茉莉营养器官中R1的总量和所占比例的动态变化，根据药用植物适宜采收期的确定原则[5-7]，认为西藏林芝地区1年生喜马拉雅紫茉莉的最佳采收时期是9月中旬，最佳采收年限为2年。笔者建议在9月中旬采收喜马拉雅紫茉莉的根，并对喜马拉雅紫茉莉的茎和叶加以利用，这不仅提高了生产效益，也使喜马拉雅紫茉莉的药用资源得到更充分的利用。
参考文献：
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准：藏药第一册[S]. 1995：104.
[2]中国科学院西北高原生物研究所. 藏药志[M]. 西宁：青海人民出版社，1991：14-16.
[3]松桂花. 浅析高海拔地区人工种植喜玛拉雅紫茉莉技术市场推广前景[J]. 中国民族医药杂志，2011，17（9）：85-86.
[4]范海霞. 喜马拉雅紫茉莉抗肿瘤活性成分研究[D]. 重庆：西南大学，2012.
[5]陈荣，杨跃生，吴鸿. 不同采收期紫锥菊产量及菊苣酸动态变化研究[J]. 中草药，2012，43（6）：1186-1190.
[6]漆小雪，韦 霄，陈宗游，等. 黄花蒿干物质的积累及青蒿素与N、P、K量的动态变化研究[J]. 中草药，2011，42（12）：2541-2544.
[7]王德立，张兴翠，孙滢. 野葛主要成分积累动态变化研究[J]. 中国药学杂志，2008，43（13）：974-977.
关键词：喜马拉雅紫茉莉；营养器官；鱼藤酮类化合物；HPLC；动态变化
中图分类号：S567.230.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0255-03
收稿日期：2013-10-26
基金项目：国家科技支撑计划（编号：2011BAI13B06）；第四次全国中药资源普查项目（编号：20120716-540000）；西藏自治区科技厅重大专项（编号：2011-68-20）。
作者简介：李连强（1981—），男，云南弥渡人，硕士，讲师，主要从事生物技术、濒危藏药材人工种植与示范的研究。E-mail：tibetfred@163.com。
通信作者：兰小中，副教授，主要从事药用植物资源教学与研究工作。E-mail：lanxiaozhong@163.com。喜马拉雅紫茉莉常指紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉[Mirabilis himalaica （Edgew.） Heimerl]的根[1]，藏语名为巴朱，具有温肾、益肾滋补、生肌、利尿、排石等功效，临床上主要用于治疗胃寒、肾寒、下身寒、阳萎浮肿等[2]。喜马拉雅紫茉莉是十余个具有国药准字号的藏药产品的主要原料之一，年需求量约500 t左右[3]，随着喜马拉雅紫茉莉制剂品种的不断增多，喜马拉雅紫茉莉药材的需求量急剧上升。笔者所在课题组通过近3年的调查发现，野生的喜马拉雅紫茉莉基本上以杂草的形式零星分布于西藏林芝、昌都、山南地区和拉萨市的田间地头，严重限制了以喜马拉雅紫茉莉为原料的藏药产业的发展。经过近6年的不断摸索，笔者所在课题组已经系统掌握了喜马拉雅紫茉莉的人工种植关键技术，提高了喜马拉雅紫茉莉的产量，改善了野生喜马拉雅紫茉莉资源匮乏的现状。但是喜马拉雅紫茉莉的传统藥用部位是根，其茎叶通常被人们弃之不用，若将其地上部位全部入药，其药源将明显扩大。
范海霞综合应用硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备HPLC 等技术，从喜马拉雅紫茉莉根中分离得到了一种鱼藤酮类化合物（rotenoids）-boeravinone C（以下简称R1），并证实R1对多种癌细胞株都有较强的抑制作用[4]，表明R1可能是喜马拉雅紫茉莉的主要活性成分之一。本研究表明，喜马拉雅紫茉莉的根、茎、叶等营养器官中均含有R1；本研究用HPLC法对笔者所在课题组在西藏林芝地区的西藏大学农牧学院动物科学学院实习基地人工种植的1年生、2年生、3年生喜马拉雅紫茉莉根、茎、叶中的R1总量及其所占比例的动态变化进行研究，以期为扩大藏药巴朱的药源提供参考依据。
1材料与方法
1.1仪器与试药
岛津LC-20高效液相色谱仪（A泵：LC-20AD、B泵：LC-20AD、DGU-20A3R在线脱气、SIL-20A自动进样器、柱温箱、SPD-20A紫外检测器）；Mettler toledo PL203分析天平；Mettler toledo B-S天平；BUCHI B-491旋转蒸发器；KQ5200型超声波清洗仪；BL-200型高速多功能粉碎机。
R1对照品由西南大学药学院的陈敏教授实验室自制，用HPLC色谱归一法测定纯度> 98%；甲醇为色谱纯；试验用水为“娃哈哈”纯净水，均经0.45 μm滤膜滤过。
1.2试验方法
1.2.1样品的采集与处理1、2、3年生喜马拉雅紫茉莉的根、茎、叶样品采自西藏大学农牧学院动物科学学院的实习基地，经西藏大学农牧学院罗建副研究员鉴定为紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉[M.himalaica （Edgew.）Heimerl]，鉴定后保存于西藏大学农牧学院的分子生物学实验室内。采样时间为2012年7至10月，每月15日左右采样，共采样4次。1、2、3年生的喜马拉雅紫茉莉分别平行采样4株。将喜马拉雅紫茉莉植株采挖后带回分子生物学实验室，洗净泥沙后分成根、茎、叶3个部分，置于105 ℃烘箱中杀青15 min后，60 ℃烘干至恒重。将同一次采收的1、2、3年生的根、茎、叶样品粉碎后分别混合，过100目筛，备用。
1.2.2色谱条件Kromosil 100-5 C18柱（150×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（70 ∶30）；流速0.8 mL/min；检测波长294 nm，柱温25 ℃。
1.2.3对照品及样品溶液的制备
1.2.3.1对照品溶液的制备精确称取4.05 mg烘干至恒重的R1对照品，用色谱纯甲醇定容至25 mL即得浓度为0162 mg/mL的R1对照品母液。取1 mL R1对照品母液，用色谱纯甲醇定容至5 mL即得浓度为0.0324 mg/mL的R1对照品溶液。
1.2.3.2R1标准曲线的绘制取浓度为0.032 4 mg/mL的R1对照品溶液，分别进样1、3、5、7、9、12、15 μL（n=3），测定其峰面积。
1.2.3.3样品溶液的制备精确称取1.000 g左右样品，加入20 mL甲醇浸泡数分钟，超声提取2次，每次30 min，滤过；合并滤液，滤液用旋转蒸发仪蒸干后用甲醇定容至2 mL，经0.45 μm滤膜滤过，滤液作为样品溶液。
1.2.4样品中R1含量测定取5 μL上述样品溶液，测定其峰面积。根据峰面积，由线性回归方程计算R1的含量。
3结论
R1对多种癌细胞株都有较强的抑制作用，表明R1可能是喜马拉雅紫茉莉的主要活性成分之一。喜马拉雅紫茉莉的传统药用部位是根，其茎叶可弃之不用，本研究采用HPLC法初步证实，喜马拉雅紫茉莉的根、茎、叶等营养器官中都含有R1，其药源将明显扩大，可以从一定程度上缓解喜马拉雅紫茉莉根产量的不足。在此基础上，本研究以1、2、3年生的喜马拉雅紫茉莉为材料，采用HPLC法研究了不同采收期对喜马拉雅紫茉莉营养器官中R1的总量和所占比例的动态变化，根据药用植物适宜采收期的确定原则[5-7]，认为西藏林芝地区1年生喜马拉雅紫茉莉的最佳采收时期是9月中旬，最佳采收年限为2年。笔者建议在9月中旬采收喜马拉雅紫茉莉的根，并对喜马拉雅紫茉莉的茎和叶加以利用，这不仅提高了生产效益，也使喜马拉雅紫茉莉的药用资源得到更充分的利用。
参考文献：
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准：藏药第一册[S]. 1995：104.
[2]中国科学院西北高原生物研究所. 藏药志[M]. 西宁：青海人民出版社，1991：14-16.
[3]松桂花. 浅析高海拔地区人工种植喜玛拉雅紫茉莉技术市场推广前景[J]. 中国民族医药杂志，2011，17（9）：85-86.
[4]范海霞. 喜马拉雅紫茉莉抗肿瘤活性成分研究[D]. 重庆：西南大学，2012.
[5]陈荣，杨跃生，吴鸿. 不同采收期紫锥菊产量及菊苣酸动态变化研究[J]. 中草药，2012，43（6）：1186-1190.
[6]漆小雪，韦 霄，陈宗游，等. 黄花蒿干物质的积累及青蒿素与N、P、K量的动态变化研究[J]. 中草药，2011，42（12）：2541-2544.
[7]王德立，张兴翠，孙滢. 野葛主要成分积累动态变化研究[J]. 中国药学杂志，2008，43（13）：974-977.