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摘要：通过单因素试验结合响应面法对广东紫珠中总黄酮的提取工艺进行优化研究。以乙醇浓度、料液比、提取时间为自变量，总黄酮提取率为响应值，设计3因素 3水平响应面分析试验，来确定广东紫珠总黄酮最佳超声提取工艺。超声波法提取广东紫珠中总黄酮的优化条件为：提取溶剂66%乙醇，料液比1 ∶42，提取时间为44 min；该条件下，总黄酮得率可达到16.15%。
关键词：广东紫珠；总黄酮；超声波提取；响应面法
中图分类号： R284.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0265-03
收稿日期：2013-10-25
基金项目：国家自然科学青年基金（编号：81102799）；江西省科技支撑计划（编号：20111BBG70030-4）；江西省博士后科研择优资助项目；江西省财政林业专项（编号：2011511201）。
作者简介：房海灵（1983—），女，山西晋中人，博士，助理研究员，主要从事药用植物资源及质量评价研究。Tel：（0791）83833641；E-mail：fanghailing2013@163.com。
通信作者：朱培林，研究员，主要从事森林药材与食品研究。Tel：（0791）83833803；E-mail：yczpl@126.com。广东紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun.）為马鞭草科（Verbenaceae）紫珠属（Callicarpa L.）多年生落叶灌木，别名万年青、珍珠风、臭常山、老鸦饭、金刀菜等。2010年版《中国药典》收载[1]，广东紫珠以干燥茎、叶入药，其味苦、涩，性凉，具有收敛止血、散瘀、清热解毒之功效，临床上常用于治疗宫颈糜烂出血、阴道炎、宫颈炎等症。研究表明，广东紫珠的主要化学成分为黄酮、苯乙醇苷、萜类及挥发油等。其中黄酮类成分如木犀草素、鼠李秦素等具有显著的抗菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[2-6]，因此，研究广东紫珠黄酮类化合物的提取工艺对广东紫珠的进一步开发利用具有重要意义。
1材料与方法
1.1材料
试验材料为广东紫珠，于2011年10月采自江西省萍乡市芦溪县。主要试剂：芸香苷对照品购于中国药品生物制品检定所（批号100802200306）。无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。主要仪器：FA1104电子天平，CTXNW 循环超声提取机，754型紫外可见分光光度计。
1.2测定方法
1.2.1标准曲线建立精确称取105 ℃干燥恒重的芸香苷对照品25.90 mg，加70%乙醇溶解并定容至25 mL中，摇匀得质量浓度1.036 mg/mL的对照品溶液，取1 mL对照品溶液至10 mL容量瓶中定容。分别取上述芸香苷对照品溶液0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mL于6个10 mL容量瓶中，各加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min后加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，6 min后加入4% NaOH溶液 2 mL，混匀，70%乙醇定容至刻度。10 min后于510 nm处测吸光度，空白试剂为参比，以吸光度为纵坐标、芸香苷质量浓度为横坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，得芸香苷质量浓度与吸光度间回归方程：D=1.036C+0.016，r=0.997。
1.2.2供试样品总黄酮含量测定称取广东紫珠粉末 0.2 g，加入提取溶液浸泡12 h后，进行提取，过滤，得样品溶液，备用。取1 mL样品溶液至10 mL容量瓶中定容，精密量取2 mL上述溶液，按照上述建立标准曲线的方法，依次加入NaNO2溶液、Al（NO3）3溶液和NaOH溶液，混匀，70%乙醇定容至刻度。静置10 min后测定吸光度，根据回归方程计算样品中总黄酮含量。
1.3提取方法确定
在相同提取温度、提取溶剂、料液比条件下，采用超声波和回流提取法对广东紫珠总黄酮进行提取，超声波提取总黄酮得率为15.43%，高于回流提取（9.98%）。此外，超声波提取操作简单，具有省时、高效、节能的优点，故本试验采用超声波提取法。
1.4超声波辅助提取总黄酮的单因素试验
分别以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度为单因素，考察各单因素对广东紫珠总黄酮得率的影响。每个单因素水平重复3次，测其吸光值。
1.5响应面分析法优化超声波辅助提取总黄酮的工艺参数
在单因素试验的基础上，确定Box-Behnken设计的自变量，运用Design-Expert 8.0.5软件程序，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[7-9]，采用3因素3水平的响应面分析法，以总黄酮得率为响应值作响应面，对提取条件进行优化。
2结果与分析
2.1超声波辅助提取广东紫珠总黄酮的单因素试验结果
2.1.1乙醇浓度对总黄酮得率的影响精确称取广东紫珠粉末0.2 g，以料液比1 g ∶40 mL分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液8 mL，50 ℃下作用 30 min，进行超声波提取，结果见图1。乙醇浓度在40%～70%范围内，总黄酮得率随乙醇浓度增加而增加，70%乙醇浓度广东紫珠总黄酮得率最高为15.69%，显著高于其他乙醇浓度的得率。乙醇浓度选用60%、70%、80%作为响应面试验的3个水平。70%显著高于其他乙醇浓度的得率，因此，乙醇浓度选用70%。
参考文献：
[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部[M]. 北京：化学工业出版社，2005：40.
[2]周伯庭，李新中，钟广蓉，等. 广东紫珠地上部位主要药效学试验[J]. 中国现代医学杂志，2006，16（2）：204-206.
[3]周伯庭，李新中，徐平声，等. 广东紫珠地上部位化学成分研究（Ⅰ）[J]. 中南药学，2004，2（4）：238-239.
[4]陈艳华，冯锋，任冬春，等. 广东紫珠地上部分的化学成分[J]. 中国天然药物，2008，6（2）：120-122.
[5]贾安，杨义芳，孔德云，等. 广东紫珠超临界提取物的GC-MS成分分析及体外抗菌活性[J]. 中国医药工业杂志，2012，43（3）：178-181.
[6]贾安，杨义芳，孔德云，等. 广东紫珠挥发油化学成分的GC-MS分析及体外抗菌活性[J]. 中药材，2012，35（3）：415-418.
[7]李君玲. 紫荆皮总黄酮超声提取工艺优化[J]. 江苏农业科学，2012，40（7）：266-267.
[8]Box G P，Hunter W G，Hunter J S. Statistics for experimenters，an introduction to design，data analysis and model building[M]. New York：John Wiley and Sons，1990.
[9]栗红生. 冬凌草总黄酮提取工艺的正交设计优化[J]. 江苏农业科学，2012，40（5）：237-238.
关键词：广东紫珠；总黄酮；超声波提取；响应面法
中图分类号： R284.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0265-03
收稿日期：2013-10-25
基金项目：国家自然科学青年基金（编号：81102799）；江西省科技支撑计划（编号：20111BBG70030-4）；江西省博士后科研择优资助项目；江西省财政林业专项（编号：2011511201）。
作者简介：房海灵（1983—），女，山西晋中人，博士，助理研究员，主要从事药用植物资源及质量评价研究。Tel：（0791）83833641；E-mail：fanghailing2013@163.com。
通信作者：朱培林，研究员，主要从事森林药材与食品研究。Tel：（0791）83833803；E-mail：yczpl@126.com。广东紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun.）為马鞭草科（Verbenaceae）紫珠属（Callicarpa L.）多年生落叶灌木，别名万年青、珍珠风、臭常山、老鸦饭、金刀菜等。2010年版《中国药典》收载[1]，广东紫珠以干燥茎、叶入药，其味苦、涩，性凉，具有收敛止血、散瘀、清热解毒之功效，临床上常用于治疗宫颈糜烂出血、阴道炎、宫颈炎等症。研究表明，广东紫珠的主要化学成分为黄酮、苯乙醇苷、萜类及挥发油等。其中黄酮类成分如木犀草素、鼠李秦素等具有显著的抗菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[2-6]，因此，研究广东紫珠黄酮类化合物的提取工艺对广东紫珠的进一步开发利用具有重要意义。
1材料与方法
1.1材料
试验材料为广东紫珠，于2011年10月采自江西省萍乡市芦溪县。主要试剂：芸香苷对照品购于中国药品生物制品检定所（批号100802200306）。无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。主要仪器：FA1104电子天平，CTXNW 循环超声提取机，754型紫外可见分光光度计。
1.2测定方法
1.2.1标准曲线建立精确称取105 ℃干燥恒重的芸香苷对照品25.90 mg，加70%乙醇溶解并定容至25 mL中，摇匀得质量浓度1.036 mg/mL的对照品溶液，取1 mL对照品溶液至10 mL容量瓶中定容。分别取上述芸香苷对照品溶液0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mL于6个10 mL容量瓶中，各加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min后加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，6 min后加入4% NaOH溶液 2 mL，混匀，70%乙醇定容至刻度。10 min后于510 nm处测吸光度，空白试剂为参比，以吸光度为纵坐标、芸香苷质量浓度为横坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，得芸香苷质量浓度与吸光度间回归方程：D=1.036C+0.016，r=0.997。
1.2.2供试样品总黄酮含量测定称取广东紫珠粉末 0.2 g，加入提取溶液浸泡12 h后，进行提取，过滤，得样品溶液，备用。取1 mL样品溶液至10 mL容量瓶中定容，精密量取2 mL上述溶液，按照上述建立标准曲线的方法，依次加入NaNO2溶液、Al（NO3）3溶液和NaOH溶液，混匀，70%乙醇定容至刻度。静置10 min后测定吸光度，根据回归方程计算样品中总黄酮含量。
1.3提取方法确定
在相同提取温度、提取溶剂、料液比条件下，采用超声波和回流提取法对广东紫珠总黄酮进行提取，超声波提取总黄酮得率为15.43%，高于回流提取（9.98%）。此外，超声波提取操作简单，具有省时、高效、节能的优点，故本试验采用超声波提取法。
1.4超声波辅助提取总黄酮的单因素试验
分别以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度为单因素，考察各单因素对广东紫珠总黄酮得率的影响。每个单因素水平重复3次，测其吸光值。
1.5响应面分析法优化超声波辅助提取总黄酮的工艺参数
在单因素试验的基础上，确定Box-Behnken设计的自变量，运用Design-Expert 8.0.5软件程序，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[7-9]，采用3因素3水平的响应面分析法，以总黄酮得率为响应值作响应面，对提取条件进行优化。
2结果与分析
2.1超声波辅助提取广东紫珠总黄酮的单因素试验结果
2.1.1乙醇浓度对总黄酮得率的影响精确称取广东紫珠粉末0.2 g，以料液比1 g ∶40 mL分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液8 mL，50 ℃下作用 30 min，进行超声波提取，结果见图1。乙醇浓度在40%～70%范围内，总黄酮得率随乙醇浓度增加而增加，70%乙醇浓度广东紫珠总黄酮得率最高为15.69%，显著高于其他乙醇浓度的得率。乙醇浓度选用60%、70%、80%作为响应面试验的3个水平。70%显著高于其他乙醇浓度的得率，因此，乙醇浓度选用70%。
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[9]栗红生. 冬凌草总黄酮提取工艺的正交设计优化[J]. 江苏农业科学，2012，40（5）：237-238.