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摘要：目的 比较云南昭通乌、绿、黄天麻中天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛的含量。方法 采用AgilentTC-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇-0.1%醋酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长270nm，柱温35 ℃。结果 四个成分的含量比较，天麻素：黄>乌>绿；腺苷：绿>乌>黄；对羟基苯甲醇：绿>黄>乌；对羟基苯甲醛：黄>乌>绿。结论 乌、绿、黄天麻中四个成分的含量有明显差异，天麻素和对羟基苯甲醛的含量以黄天麻最高，腺苷和对羟基苯甲醇的含量以绿天麻最高。
关键词：天麻；天麻素；腺苷；对羟基苯甲醇；对羟基苯甲醛
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2014）07-0062-03
天麻（Gastrodia elata Bl.）是我国的名贵中药，临床多用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等症。作为道地药材的云南昭通天麻有乌天麻（Gastrodia elata Bl.f.glauca）、黄天麻（Gastrodia elata Bl.f.flavida）和绿天麻（Gastrodia elata Bl.f.viridis）三种变型。天麻主要含有酚类、有机酸类、含氮类、甾醇及多糖类化合物，其中天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和腺苷等化合物认为是天麻的主要活性成分。但是《中国药典》2010年版（一部）天麻含量测定项下，仅对天麻素做了相关规定[1]，为更加客观、全面的评价云南昭通天麻质量，对其进行质量控制，本研究建立了4个成分同时测定的HPLC方法，并对乌、绿、黄三种天麻变型进行了含量分析和比较。
1仪器与供试药
安捷伦高效液相色谱仪，二级管阵列检测器。天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛对照品（中国药品生物制品检定所提供），乌天麻、黄天麻、绿天麻干品，均购于昭通天麻研究所，经昭通天麻研究所陈顺芳老师鉴定。甲醇为色谱纯，醋酸为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A-甲醇，B-0.1%醋酸水溶液；线性梯度洗脱程序：0～30 min，5% A；30～35 min，20% A；35～55 min，25% A；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：270 nm；柱温35℃；进样量20 μL。
在上述色谱条件下，天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛主色谱峰与相邻其它色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数不低于5000。对照品和三种天麻样品色谱。
1.天麻素；2.腺苷；3.对羟基苯甲醇；4.对羟基苯甲醛
2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛适量，置同一25 mL量瓶中，加10%甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度分别为383，12.4，49.0，5.6 mg·L-1的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取本品药材粉末（过40目筛）约0.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入蒸馏水20 mL，称重，加热回流提取1 h，放冷再称重，用蒸馏水补足减失的质量，离心。精密量取上清液5 mL于烧杯中，加入甲醇约20 mL，振摇3 min至白色絮状沉淀产生完全，离心。上清液浓缩至近干，残渣加10%甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，并用10%甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 线性关系考察 分别精密量取混合对照品溶液0.5，1.0，2.5，4.0，5.0，10.0 mL置10 mL量瓶中，加10%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的系列混合对照品溶液。在上述色谱条件下进行分析，以峰面积Y对浓度X（mg·L-1）绘制标准曲线，得天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛的回归方程和相应的R2值分别为：y=14.792x-10.203，R2=0.998；y=1.017x-0.2569，R2=0.9975；y=4.2738x-1.0872，R2=0.9975；y=0.395x-0.1814，R2=0.9965。
结果表明天麻素、 腺苷、 对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛分的线性关系良好。
2.5 精密度试验 取同一混合对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，记录各自峰面积，计算天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛峰面积的RSD分别为1.4、1.1、1.4、1.1%。
2.6 重复性试验 精密称取天麻（乌天麻）粉末0.5 g，按2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，计算含量。天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛含量的RSD分别为1.8，2.0，2.4，1.9%。
2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温放置，分别在0，3，5，8，12，24 h进样分析，记录各自峰面积，天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛峰面积的RSD分别为1.7，1.1，1.5，1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 加样回收率试验 称取已知含量的乌天麻粉末9 份，3份为一组，每份0.25 g，精密称定。分别精密加入对照品适量，按2.3项下方法制成低、中、高3个浓度的供试品溶液，进样分析。天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛平均回收率（n=9）。
2.9 样品含量测定 分别称取各种天麻药材粉末（过40目筛）约0.5 g，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件进行分析，采用外标法以峰面积计算天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛的含量。
3 讨论
一般认为天麻素是天麻主要的活性成分，国家药典中天麻质量标准的制定也主要以天麻素的含量作为重要的参考指标，但多项有关天麻素的药理研究报道，天麻素并没有表现出与药效相关的药理活性。目前与天麻活性有关的成分研究主要以天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛为主。天麻原药材中提取的天麻素及人工合成天麻素均无镇静安定作用[2]；并且临床报道天麻可以明显改善与脑供血不足有关的某些疾病的症状，而天麻素在实验中也未能表现出与天麻相似的增加血流量及抗缺氧的作用[3～4]。笔者前期研究结果显示：天麻提取物及酚类成分对脑缺血损伤具有明显的保护作用[5～8].其中的活性成分对羟基苯甲醇可通过减轻神经细胞损伤对脑缺血再灌注损伤具有保护作用[9～10]；对羟基苯甲醛在体内、体外均有抗血小板聚集活性，且其作用具有选择性对抗ADP途径的血小板聚集[11]；腺苷能穿过血脑屏障发挥睡眠调节作用[12～16]。 多年的药理研究表明中药发挥其药效作用往往是由多个成分，及其协同而发挥作用作用的，因此以药材中含有的单一成分作为质量控制指标的方法可能不能全面的评价其质量[17]。目前关于天麻药材质量控制方法《中国药典》2010年版（一部）仅以天麻素作为质量控制指标，但本研究以天麻的主要活性成分天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛为研究对象，建立了对4个成分同时测定的HPLC方法，并对乌、绿、黄三种昭通天麻变型进行了含量分析和比较，结果显示：乌、绿、黄天麻中四个成分的含量有明显差异，天麻素和对羟基苯甲醛的含量以黄天麻最高，腺苷和对羟基苯甲醇的含量以绿天麻最高。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2010：39.
[2]黄俊华.天麻注射液及天麻甙药理作用的初步研究[J].中国医学科学院学报，1985，7（5）：399.
[3]黄俊华，王桂莲.天麻注射液、去天麻甙部分和天麻甙药理作用的比较[J].中国医学科学院学报，1989，2（11）：147.
[4]田野，李秀芳，杨莲，等.HPLC法对三产地天麻中天麻素的含量测定[J].云南中医学院学报，2008，31（3）：6-8.
[5]段小花，李秀芳，周宁娜，等.天麻提取物对VD大鼠学习记忆及海马氧化损伤的作用[J].中成药，2011，33（7）：46-49.
[6]段小花，代蓉，李秀芳，等.天麻酚类成分对脑缺血大鼠海马NO和NOS的影响[J].中华老年心脑血管杂志，2011，13（7）：657-659.
[7]段小花，吴霜，王莉莉，等.天麻乙酸乙酯提取物对血管性痴呆大鼠海马CA1区锥体细胞的影响[J].中华老年心脑血管病杂志，2013，15（2）：197-199.
[8]段小花，李国花，吴霜，等.天麻乙酸乙酯提取物对大脑中动脉栓塞模型大鼠神经突触可塑性的影响[J].中国实验方剂学杂志.2013，19（1）：167-171.
[9]Descamps E，Petrault-Laprais M，Maurois P，et al.Experimental stroke protection induced by 4-hydroxybenzyl alcoholis cancelled by bacitracin[J].Neurosci Res，2009，64（2）：137-142.
[10]Yu SS，Zhao J，Zheng WP，et al.Neuroprotective effect of 4-hydroxybenzyl alcohol against transient focal cerebral ischemia via anti-apoptosis in rats[J].Brain Research，2010，1308（13）：167-175.
[11]李秀芳，代蓉，林青，等.天麻成分对羟基苯甲醛抗血小板聚集作用及急性毒性研究[J].天然产物研究与开发，2013，2（5）：317-320.
[12]Zhang Y，Li M，Kang R X，Shi J G，Liμ G T，Zhang J J.NHBA isolated from Gastrodia elata exerts sedative and hypnotic effects in sodiμm pentobarbital-treated mice[J].Pharmacol Biochem Behav，2012；102（3）：450-457.
[13]Aaron J.Carman，Jeffrey H.Mills，Antje Krenz.Adenosine Receptor Signaling Modulates Permeability of the Blood–Brain Barrier[J].The Journal of Neuroscienc，2011，31（37）：13272-13280.
[14]Haas HL，Greene RW.Adenosine enhances afterhyperpolarization and accommodation in hippocampal pyramidal cells[J].Pflügers Archiv，1984，402（3）：244-247.
[15]曲衛敏，孙宇，许奇，等.腺苷和睡眠觉醒调节[J].生物物理学报，2011，27（1）：5-17.
[16]张少丹，钱培德，蔡宝萍，等.外源性腺苷对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的治疗作用[J].实用儿科临床杂志，2002，17：45-47.
[17]闫宝庆，张晖芬，逄楠楠，等.RP-HPLC同时测定天麻中4种成分的含量[J].中国中药杂志，2009，22（34）：2903-2906.
（收稿日期：2014-05-04）
关键词：天麻；天麻素；腺苷；对羟基苯甲醇；对羟基苯甲醛
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2014）07-0062-03
天麻（Gastrodia elata Bl.）是我国的名贵中药，临床多用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等症。作为道地药材的云南昭通天麻有乌天麻（Gastrodia elata Bl.f.glauca）、黄天麻（Gastrodia elata Bl.f.flavida）和绿天麻（Gastrodia elata Bl.f.viridis）三种变型。天麻主要含有酚类、有机酸类、含氮类、甾醇及多糖类化合物，其中天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和腺苷等化合物认为是天麻的主要活性成分。但是《中国药典》2010年版（一部）天麻含量测定项下，仅对天麻素做了相关规定[1]，为更加客观、全面的评价云南昭通天麻质量，对其进行质量控制，本研究建立了4个成分同时测定的HPLC方法，并对乌、绿、黄三种天麻变型进行了含量分析和比较。
1仪器与供试药
安捷伦高效液相色谱仪，二级管阵列检测器。天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛对照品（中国药品生物制品检定所提供），乌天麻、黄天麻、绿天麻干品，均购于昭通天麻研究所，经昭通天麻研究所陈顺芳老师鉴定。甲醇为色谱纯，醋酸为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A-甲醇，B-0.1%醋酸水溶液；线性梯度洗脱程序：0～30 min，5% A；30～35 min，20% A；35～55 min，25% A；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：270 nm；柱温35℃；进样量20 μL。
在上述色谱条件下，天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛主色谱峰与相邻其它色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数不低于5000。对照品和三种天麻样品色谱。
1.天麻素；2.腺苷；3.对羟基苯甲醇；4.对羟基苯甲醛
2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛适量，置同一25 mL量瓶中，加10%甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度分别为383，12.4，49.0，5.6 mg·L-1的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取本品药材粉末（过40目筛）约0.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入蒸馏水20 mL，称重，加热回流提取1 h，放冷再称重，用蒸馏水补足减失的质量，离心。精密量取上清液5 mL于烧杯中，加入甲醇约20 mL，振摇3 min至白色絮状沉淀产生完全，离心。上清液浓缩至近干，残渣加10%甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，并用10%甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 线性关系考察 分别精密量取混合对照品溶液0.5，1.0，2.5，4.0，5.0，10.0 mL置10 mL量瓶中，加10%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的系列混合对照品溶液。在上述色谱条件下进行分析，以峰面积Y对浓度X（mg·L-1）绘制标准曲线，得天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛的回归方程和相应的R2值分别为：y=14.792x-10.203，R2=0.998；y=1.017x-0.2569，R2=0.9975；y=4.2738x-1.0872，R2=0.9975；y=0.395x-0.1814，R2=0.9965。
结果表明天麻素、 腺苷、 对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛分的线性关系良好。
2.5 精密度试验 取同一混合对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，记录各自峰面积，计算天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛峰面积的RSD分别为1.4、1.1、1.4、1.1%。
2.6 重复性试验 精密称取天麻（乌天麻）粉末0.5 g，按2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，计算含量。天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛含量的RSD分别为1.8，2.0，2.4，1.9%。
2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温放置，分别在0，3，5，8，12，24 h进样分析，记录各自峰面积，天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛峰面积的RSD分别为1.7，1.1，1.5，1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 加样回收率试验 称取已知含量的乌天麻粉末9 份，3份为一组，每份0.25 g，精密称定。分别精密加入对照品适量，按2.3项下方法制成低、中、高3个浓度的供试品溶液，进样分析。天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛平均回收率（n=9）。
2.9 样品含量测定 分别称取各种天麻药材粉末（过40目筛）约0.5 g，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件进行分析，采用外标法以峰面积计算天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛的含量。
3 讨论
一般认为天麻素是天麻主要的活性成分，国家药典中天麻质量标准的制定也主要以天麻素的含量作为重要的参考指标，但多项有关天麻素的药理研究报道，天麻素并没有表现出与药效相关的药理活性。目前与天麻活性有关的成分研究主要以天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛为主。天麻原药材中提取的天麻素及人工合成天麻素均无镇静安定作用[2]；并且临床报道天麻可以明显改善与脑供血不足有关的某些疾病的症状，而天麻素在实验中也未能表现出与天麻相似的增加血流量及抗缺氧的作用[3～4]。笔者前期研究结果显示：天麻提取物及酚类成分对脑缺血损伤具有明显的保护作用[5～8].其中的活性成分对羟基苯甲醇可通过减轻神经细胞损伤对脑缺血再灌注损伤具有保护作用[9～10]；对羟基苯甲醛在体内、体外均有抗血小板聚集活性，且其作用具有选择性对抗ADP途径的血小板聚集[11]；腺苷能穿过血脑屏障发挥睡眠调节作用[12～16]。 多年的药理研究表明中药发挥其药效作用往往是由多个成分，及其协同而发挥作用作用的，因此以药材中含有的单一成分作为质量控制指标的方法可能不能全面的评价其质量[17]。目前关于天麻药材质量控制方法《中国药典》2010年版（一部）仅以天麻素作为质量控制指标，但本研究以天麻的主要活性成分天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛为研究对象，建立了对4个成分同时测定的HPLC方法，并对乌、绿、黄三种昭通天麻变型进行了含量分析和比较，结果显示：乌、绿、黄天麻中四个成分的含量有明显差异，天麻素和对羟基苯甲醛的含量以黄天麻最高，腺苷和对羟基苯甲醇的含量以绿天麻最高。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2010：39.
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[3]黄俊华，王桂莲.天麻注射液、去天麻甙部分和天麻甙药理作用的比较[J].中国医学科学院学报，1989，2（11）：147.
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[6]段小花，代蓉，李秀芳，等.天麻酚类成分对脑缺血大鼠海马NO和NOS的影响[J].中华老年心脑血管杂志，2011，13（7）：657-659.
[7]段小花，吴霜，王莉莉，等.天麻乙酸乙酯提取物对血管性痴呆大鼠海马CA1区锥体细胞的影响[J].中华老年心脑血管病杂志，2013，15（2）：197-199.
[8]段小花，李国花，吴霜，等.天麻乙酸乙酯提取物对大脑中动脉栓塞模型大鼠神经突触可塑性的影响[J].中国实验方剂学杂志.2013，19（1）：167-171.
[9]Descamps E，Petrault-Laprais M，Maurois P，et al.Experimental stroke protection induced by 4-hydroxybenzyl alcoholis cancelled by bacitracin[J].Neurosci Res，2009，64（2）：137-142.
[10]Yu SS，Zhao J，Zheng WP，et al.Neuroprotective effect of 4-hydroxybenzyl alcohol against transient focal cerebral ischemia via anti-apoptosis in rats[J].Brain Research，2010，1308（13）：167-175.
[11]李秀芳，代蓉，林青，等.天麻成分对羟基苯甲醛抗血小板聚集作用及急性毒性研究[J].天然产物研究与开发，2013，2（5）：317-320.
[12]Zhang Y，Li M，Kang R X，Shi J G，Liμ G T，Zhang J J.NHBA isolated from Gastrodia elata exerts sedative and hypnotic effects in sodiμm pentobarbital-treated mice[J].Pharmacol Biochem Behav，2012；102（3）：450-457.
[13]Aaron J.Carman，Jeffrey H.Mills，Antje Krenz.Adenosine Receptor Signaling Modulates Permeability of the Blood–Brain Barrier[J].The Journal of Neuroscienc，2011，31（37）：13272-13280.
[14]Haas HL，Greene RW.Adenosine enhances afterhyperpolarization and accommodation in hippocampal pyramidal cells[J].Pflügers Archiv，1984，402（3）：244-247.
[15]曲衛敏，孙宇，许奇，等.腺苷和睡眠觉醒调节[J].生物物理学报，2011，27（1）：5-17.
[16]张少丹，钱培德，蔡宝萍，等.外源性腺苷对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的治疗作用[J].实用儿科临床杂志，2002，17：45-47.
[17]闫宝庆，张晖芬，逄楠楠，等.RP-HPLC同时测定天麻中4种成分的含量[J].中国中药杂志，2009，22（34）：2903-2906.
（收稿日期：2014-05-04）