论文部分内容阅读
【中图分类号】R285 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2013）11-0605-01
【摘要】目的 研究藤黄酸对膀胱癌细胞增殖抑制作用可能的机制。方法不同浓度藤黄酸作用于膀胱癌细胞后，MTT法检测膀胱癌细胞增殖抑制率变化，流式细胞术检测膀胱癌细胞凋亡情况。结果 藤黄酸能明显呈浓度依赖性抑制BIU-87膀胱癌细胞的生长； 经藤黄酸处理后，可以导致BIU-87膀胱癌细胞的凋亡。结论藤黄酸能明显抑制膀胱癌细胞株BIU-87细胞的生长，并促膀胱癌细胞凋亡，这种作用具有明显时间剂量效应。
【关键词】 藤黄酸； 膀胱癌； 凋亡；
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，多发难治，且术后复发率高，严重威胁着人类的健康和生命[1]。膀胱癌的发病率占全身肿瘤1%，占全部恶性肿瘤3%。男女之比为3：l，发病年龄多在50-70岁间。近年来传统中医药在抗肿瘤方面的作用得到了深入的研究，越来越多的中药被应用在肿瘤的治疗当中。藤黄系藤黄科植物藤黄所分泌出的干燥树脂。呈圆柱状或不规则块状物，黄棕色，质脆易碎。藤黄酸（Ggambogic acid， GA，）为藤黄的重要活性成分之一，具有多种生物学功能，包括：抗炎、抗氧化、抗病毒、抗感染的作用[2]，同时还具有良好的体内外抗肿瘤作用，可抑制多种肿瘤细胞的生长，并且诱导肿瘤细胞凋亡。近期的研究表明，GA能抑制包括肝癌、胃癌、乳腺癌以及血液系肿瘤在内的多种肿瘤细胞的生长，其对泌尿系肿瘤作用的报道尚少。
本研究对藤黄酸抑制膀胱癌细胞生长的机制作进一步探讨。结果显示，藤黄酸可以抑制膀胱癌细胞增殖并促进膀胱癌细胞凋亡作用。
1 材料及方法
1.1 GA为江苏康缘药业公司产品，RPMI1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司，噻唑蓝（M1Tr）、胰蛋白酶购自美国Sigma公司，AnnexinV.FITC凋亡检测试剂盒购自美国BIPEC公司，细胞周期检测试剂盒购自南京凯基公司。人膀胱癌细胞株BIU-87购于中国科学院昆明细胞库。
1.2 实验分组 本实验共分为4组，藤黄酸1.0μmol/L组、2.0μmol/L组、3.0μmol/L组及阴性对照组。
1.3 细胞传代及培养 膀胱癌细胞生长在含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液中，于37℃恒温、5%CO2、饱和湿度培养箱中，每2-3 d换液传代1次。将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。加入0.5～1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1～3分钟。用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。取对数生长期细胞用于实验。
1.4 MTT检测细胞增殖 取对数生长期细胞胰酶消化、细胞计数，以5*105/瓶细胞数转至6孔板培养16h，加无血清培養基同步化12h，进行加药处理，给药浓度分别为1.0μmol/L、2.0μmol/L、3.0μmol/L。将处于对数生长期的骨肉瘤细胞于转染后的第24h、48h加入MTT20μl/孔（5mg/ml），继续培养4h后吸弃上清。加入二甲亚砜150μl/孔，溶解甲瓒紫结晶，酶标仪570nm波长下测定吸光度A值，每孔设3个复孔取均值，计算抑制率。相对抑制率=（1-转染组/ 对照组）×100﹪。
1.5 细胞凋亡实验 取对数生长期细胞胰酶消化、细胞计数，以5*105/瓶细胞数转至6孔板培养16h，加无血清培养基同步化12h，进行加药处理，给药浓度分别为1.0μmol/L、2.0μmol/L、3.0μmol/L。分别给药作用24h和48h后，胰酶消化，离心收集细胞，用冷PBS 洗涤两次，加入100μL 1X annexin-binding buffer溶解，按照凋亡检测试剂盒操作依次加入检测试剂 。流式检测细胞凋亡 。
1.6 统计学分析 采用SPSS 121 0 软件包处理数据， 采用单因素方差分析， 以P< 01 05 为差异具有统计学意义， 实验数据均重复测定3 次以上。
2 实验结果
2.1 MTT结果呈现浓度依赖性抑制膀胱癌细胞增殖，藤黄酸 对膀胱癌细胞的增殖抑制如表1所示。结果显示，藤黄酸能明显抑制BIU-87膀胱癌细胞增殖，并且这种抑制作用呈浓度-时间依赖性增强。
3 讨论
中药藤黄系藤黄属，植物藤黄树的树干被割伤后流出的胶状树脂，呈橙色圆柱状或块状，质脆易碎。藤黄属植物在系统分类上属藤黄科、藤黄亚科、藤黄族、藤黄属。据中国植物志记载，本科约40属，1000种，分别隶属5亚科，主要分布在热带，但有两属即金丝桃属和三腺金丝桃属分布在温带。我国有8属87种，几乎遍布全国各地，分别隶属于3亚科，即金丝桃亚科、红厚壳亚科和藤黄亚科。藤黄亚科有2族，共18属，主要分布在亚洲热带，其次在大洋洲及非洲南部；我国仅有藤黄族藤黄属1族1属，分布于华中，华南及西南各地。因此，我国的药用藤黄仍主要依靠进口[3]。
近20年来，国内外特别是我国学者，对藤黄及其活性成分藤黄酸等做了大量的研究工作[4-6]。实验表明藤黄酸能抑制Hela细胞生长，对其有明显的杀伤作用，对小鼠腹水型肝癌细胞和人体肝癌细胞有抑制作用。藤黄对S37、S180、AR44、W256、ECA和肝癌腹水等六种动物瘤株有明显的抑制作用。而且，藤黄酸可显著抑制人肝癌细胞的增殖。藤黄乙醇提取物（736-1）对小鼠网状细胞肉瘤腹水型具有抗肿瘤活性，对ARS瘤细胞的ACP活性和DNA合成功能具明显抑制作用。临床研究显示，应用藤黄酸注射液，单一给药治疗乳腺癌、皮肤癌、阴茎癌、头颈部癌、恶性淋巴瘤；应用藤黄针剂、片剂、软膏治疗乳腺癌，都有一定的疗效。此外，在临床研究中，藤黄还被用于治疗带状疤疹、单纯疤疹、局部急性炎症、生殖器疙疹以及痊疮等，疗效显著。目前报道主要是将藤黄的总提取物溶于生理盐水使用。最近有研究表明藤黄酸对于胰腺癌细胞具有一定的抑制作用和诱导凋亡作用。 近几年中国药科大学抗肿瘤药物研究室开始对藤黄酸进行研究，并且进行了一些结构修饰和抗癌的活性测定，江苏省科委组织中国药科大学按照第一类（中药、天然药物）新药要求，对藤黄酸及其注射剂开展全方位研究。该项目被评为国家重大科技专项“创新药物和中药现代化”项目（863）（2002AA2Z3112）、江苏省科技厅“十五”科技攻关重大项目（BE2001618）。目前已完成临床前研究，进入I期临床研究阶段。
在本实验中，通过MTT检测我们观察到各实验组对BIU-87膀胱癌细胞增殖的抑制作用均明显高于对照组，且随时间推移，抑制率增加。通过细胞凋亡实验检测，各实验组对BIU-87膀胱癌细胞的凋亡作用均明显高于对照组，且随时间推移，凋亡率增加。结果显示，藤黄酸可以抑制BIU-87膀胱癌细胞增殖并促进膀胱癌细胞凋亡作用。藤黄酸对于膀胱癌的治疗有潜在的应用价值。
参考文献
[1] 贡震，韩从辉.浅表性膀胱癌的灌注治疗[J].中华泌尿外科杂志，2009，30（10）：17-19.
[2] 贺百花，彭求贤，高倩，等.中药藤黄药理作用研究進展[J].河北北方学院学报（医学版）.2009，26（5）：71-72.
[3] 邹明宏，杜丽清，曾辉，等.藤黄属植物（Garcinia）资源与利用研究进展[J].热带作物学报，2007，28（4）：124-127.
[4] 刘若庸，王洁，李德华，等.藤黄制剂与放疗合用对小鼠肿瘤MA-737的疗效观察[J].天津药学，1989，（06）：8-11.
[5] Han-Zhong Zhang， Shailaja Kasibhatla， Yan Wang， et al. Discovery， characterization and SAR of gambogic acid as a potent apoptosis inducer by a HTS assay[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry，2004，12（2）： 309-317.
[6] 顾红燕，郭青龙，尤启冬，等.藤黄酸促进bax和p53表达诱导人肝细胞癌细胞SMMC-7721凋亡[J].中国天然药物，2005，3（3）：168-172.
【摘要】目的 研究藤黄酸对膀胱癌细胞增殖抑制作用可能的机制。方法不同浓度藤黄酸作用于膀胱癌细胞后，MTT法检测膀胱癌细胞增殖抑制率变化，流式细胞术检测膀胱癌细胞凋亡情况。结果 藤黄酸能明显呈浓度依赖性抑制BIU-87膀胱癌细胞的生长； 经藤黄酸处理后，可以导致BIU-87膀胱癌细胞的凋亡。结论藤黄酸能明显抑制膀胱癌细胞株BIU-87细胞的生长，并促膀胱癌细胞凋亡，这种作用具有明显时间剂量效应。
【关键词】 藤黄酸； 膀胱癌； 凋亡；
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，多发难治，且术后复发率高，严重威胁着人类的健康和生命[1]。膀胱癌的发病率占全身肿瘤1%，占全部恶性肿瘤3%。男女之比为3：l，发病年龄多在50-70岁间。近年来传统中医药在抗肿瘤方面的作用得到了深入的研究，越来越多的中药被应用在肿瘤的治疗当中。藤黄系藤黄科植物藤黄所分泌出的干燥树脂。呈圆柱状或不规则块状物，黄棕色，质脆易碎。藤黄酸（Ggambogic acid， GA，）为藤黄的重要活性成分之一，具有多种生物学功能，包括：抗炎、抗氧化、抗病毒、抗感染的作用[2]，同时还具有良好的体内外抗肿瘤作用，可抑制多种肿瘤细胞的生长，并且诱导肿瘤细胞凋亡。近期的研究表明，GA能抑制包括肝癌、胃癌、乳腺癌以及血液系肿瘤在内的多种肿瘤细胞的生长，其对泌尿系肿瘤作用的报道尚少。
本研究对藤黄酸抑制膀胱癌细胞生长的机制作进一步探讨。结果显示，藤黄酸可以抑制膀胱癌细胞增殖并促进膀胱癌细胞凋亡作用。
1 材料及方法
1.1 GA为江苏康缘药业公司产品，RPMI1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司，噻唑蓝（M1Tr）、胰蛋白酶购自美国Sigma公司，AnnexinV.FITC凋亡检测试剂盒购自美国BIPEC公司，细胞周期检测试剂盒购自南京凯基公司。人膀胱癌细胞株BIU-87购于中国科学院昆明细胞库。
1.2 实验分组 本实验共分为4组，藤黄酸1.0μmol/L组、2.0μmol/L组、3.0μmol/L组及阴性对照组。
1.3 细胞传代及培养 膀胱癌细胞生长在含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液中，于37℃恒温、5%CO2、饱和湿度培养箱中，每2-3 d换液传代1次。将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。加入0.5～1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1～3分钟。用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。取对数生长期细胞用于实验。
1.4 MTT检测细胞增殖 取对数生长期细胞胰酶消化、细胞计数，以5*105/瓶细胞数转至6孔板培养16h，加无血清培養基同步化12h，进行加药处理，给药浓度分别为1.0μmol/L、2.0μmol/L、3.0μmol/L。将处于对数生长期的骨肉瘤细胞于转染后的第24h、48h加入MTT20μl/孔（5mg/ml），继续培养4h后吸弃上清。加入二甲亚砜150μl/孔，溶解甲瓒紫结晶，酶标仪570nm波长下测定吸光度A值，每孔设3个复孔取均值，计算抑制率。相对抑制率=（1-转染组/ 对照组）×100﹪。
1.5 细胞凋亡实验 取对数生长期细胞胰酶消化、细胞计数，以5*105/瓶细胞数转至6孔板培养16h，加无血清培养基同步化12h，进行加药处理，给药浓度分别为1.0μmol/L、2.0μmol/L、3.0μmol/L。分别给药作用24h和48h后，胰酶消化，离心收集细胞，用冷PBS 洗涤两次，加入100μL 1X annexin-binding buffer溶解，按照凋亡检测试剂盒操作依次加入检测试剂 。流式检测细胞凋亡 。
1.6 统计学分析 采用SPSS 121 0 软件包处理数据， 采用单因素方差分析， 以P< 01 05 为差异具有统计学意义， 实验数据均重复测定3 次以上。
2 实验结果
2.1 MTT结果呈现浓度依赖性抑制膀胱癌细胞增殖，藤黄酸 对膀胱癌细胞的增殖抑制如表1所示。结果显示，藤黄酸能明显抑制BIU-87膀胱癌细胞增殖，并且这种抑制作用呈浓度-时间依赖性增强。
3 讨论
中药藤黄系藤黄属，植物藤黄树的树干被割伤后流出的胶状树脂，呈橙色圆柱状或块状，质脆易碎。藤黄属植物在系统分类上属藤黄科、藤黄亚科、藤黄族、藤黄属。据中国植物志记载，本科约40属，1000种，分别隶属5亚科，主要分布在热带，但有两属即金丝桃属和三腺金丝桃属分布在温带。我国有8属87种，几乎遍布全国各地，分别隶属于3亚科，即金丝桃亚科、红厚壳亚科和藤黄亚科。藤黄亚科有2族，共18属，主要分布在亚洲热带，其次在大洋洲及非洲南部；我国仅有藤黄族藤黄属1族1属，分布于华中，华南及西南各地。因此，我国的药用藤黄仍主要依靠进口[3]。
近20年来，国内外特别是我国学者，对藤黄及其活性成分藤黄酸等做了大量的研究工作[4-6]。实验表明藤黄酸能抑制Hela细胞生长，对其有明显的杀伤作用，对小鼠腹水型肝癌细胞和人体肝癌细胞有抑制作用。藤黄对S37、S180、AR44、W256、ECA和肝癌腹水等六种动物瘤株有明显的抑制作用。而且，藤黄酸可显著抑制人肝癌细胞的增殖。藤黄乙醇提取物（736-1）对小鼠网状细胞肉瘤腹水型具有抗肿瘤活性，对ARS瘤细胞的ACP活性和DNA合成功能具明显抑制作用。临床研究显示，应用藤黄酸注射液，单一给药治疗乳腺癌、皮肤癌、阴茎癌、头颈部癌、恶性淋巴瘤；应用藤黄针剂、片剂、软膏治疗乳腺癌，都有一定的疗效。此外，在临床研究中，藤黄还被用于治疗带状疤疹、单纯疤疹、局部急性炎症、生殖器疙疹以及痊疮等，疗效显著。目前报道主要是将藤黄的总提取物溶于生理盐水使用。最近有研究表明藤黄酸对于胰腺癌细胞具有一定的抑制作用和诱导凋亡作用。 近几年中国药科大学抗肿瘤药物研究室开始对藤黄酸进行研究，并且进行了一些结构修饰和抗癌的活性测定，江苏省科委组织中国药科大学按照第一类（中药、天然药物）新药要求，对藤黄酸及其注射剂开展全方位研究。该项目被评为国家重大科技专项“创新药物和中药现代化”项目（863）（2002AA2Z3112）、江苏省科技厅“十五”科技攻关重大项目（BE2001618）。目前已完成临床前研究，进入I期临床研究阶段。
在本实验中，通过MTT检测我们观察到各实验组对BIU-87膀胱癌细胞增殖的抑制作用均明显高于对照组，且随时间推移，抑制率增加。通过细胞凋亡实验检测，各实验组对BIU-87膀胱癌细胞的凋亡作用均明显高于对照组，且随时间推移，凋亡率增加。结果显示，藤黄酸可以抑制BIU-87膀胱癌细胞增殖并促进膀胱癌细胞凋亡作用。藤黄酸对于膀胱癌的治疗有潜在的应用价值。
参考文献
[1] 贡震，韩从辉.浅表性膀胱癌的灌注治疗[J].中华泌尿外科杂志，2009，30（10）：17-19.
[2] 贺百花，彭求贤，高倩，等.中药藤黄药理作用研究進展[J].河北北方学院学报（医学版）.2009，26（5）：71-72.
[3] 邹明宏，杜丽清，曾辉，等.藤黄属植物（Garcinia）资源与利用研究进展[J].热带作物学报，2007，28（4）：124-127.
[4] 刘若庸，王洁，李德华，等.藤黄制剂与放疗合用对小鼠肿瘤MA-737的疗效观察[J].天津药学，1989，（06）：8-11.
[5] Han-Zhong Zhang， Shailaja Kasibhatla， Yan Wang， et al. Discovery， characterization and SAR of gambogic acid as a potent apoptosis inducer by a HTS assay[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry，2004，12（2）： 309-317.
[6] 顾红燕，郭青龙，尤启冬，等.藤黄酸促进bax和p53表达诱导人肝细胞癌细胞SMMC-7721凋亡[J].中国天然药物，2005，3（3）：168-172.