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摘要：水体中的氮素污染问题日益突出，废水脱氮越来越受到重视。厌氧生物脱氮方法因能耗低、无二次污染等优点，具有一定的发展前景。相关研究主要集中在厌氧氨氧化（Anaerobic ammonium oxidation，Anammox）和厌氧甲烷氧化反硝化（Denitrifying anaerobic methane Oxidation，DAMO）。深入了解脱氮过程的发生机理，可以为今后工艺应用提供理论基础。本文重点介绍参与脱氮过程的微生物并阐述脱氮机制，探讨新型脱氮工艺的应用前景。
关键词：生物脱氮；厌氧氨氧化；甲烷氧化反硝化
近年来，氮素给环境造成的污染问题日益突出，其危害也日益受到人们的重视。有效降低废水中氮素浓度，已成为现代废水处理技术的一项新课题。在众多废水脱氮处理方法中，厌氧生物脱氮因其成本低廉、高效、无二次污染和易操作等优点，具有一定的发展前景。本文就新型厌氧脱氮微生物及工艺研究进展进行阐述。
1 新型厌氧脱氮微生物种类
1.1厌氧氨氧化菌
1995年Mulder等在进行反硝化小试研究时，发现了以NH4+为电子供体还原NO3-的厌氧氨氧化，该过程不需要外加碳源，能耗低。随后，Anammox 菌得到了深入的研究。至今为止，共发现10种Anammox菌，分别是Candidatus“Brocadia anammoxidans”、Candidatus Scalindua sorokinii、Candidatus Scalindua wagneri、Candidatus Scalindua brodae、Candidatus Brocadia fulgida、Candidatus Anammoxoglobus propionicus、Candidatus Jettenia asiatica、Candidatus Scalindua Arabica、Candidatus Brocadia sinica。它们均属于浮霉状菌目（Planctomycetes）[1]。
1.2厌氧甲烷氧化反硝化菌
厌氧甲烷氧化反硝化过程分为亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化和硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化。Raghoebarsing等（2009）[2]富集了获得亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化菌，并通过FISH、脂质分析及16S rRNA基因检测确定该类菌隶属于细菌，NC10门，可独立完成厌氧甲烷氧化反硝化过程，随后，该细菌被命名为“Candidatus Methylmirabilis oxyfera”。Haroon等（2013）[3]首次富集到硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化菌，进一步运用宏基因组、宏转录组和同位素分析方法证实可完成此过程的古菌属于ANME-2d，将其命名为“Candidatus Methanoperedens Nitroreducens”。
2厌氧微生物脱氮机制
2.1厌氧氨氧化过程
厌氧氨氧化（Anammox） 是指在厌氧条件下，氨以亚硝酸盐为电子受体直接被氧化为氮气的生物反应。Vande Graff等在1997年用15N示踪法研究并构建了厌氧氨氧化的代谢模型[4]。该代谢过程（图1）是在多种酶的催化下完成的，主要包括亚硝酸盐还原酶（Nir）、硝酸盐还原酶 （ Nar ）、羟胺氧化还原酶（ HAO ）、联氨氧化酶（ HZO）、联氨水解酶（ HH）、联氨脱氢酶（ HD）等。Nir、Nar、HAO在好氧氨氧化细菌和反硝化细菌中均能发现，但在好氧氨氧化细菌和反硝化细菌中的HAO与Anammox菌中的HAO功能有差异。前者能将NO转化为羟胺 [5]，同时也能将羟胺转化为亚硝酸；后者能将羟胺转化为 NO，并且能催化氧化联氨。HZO、HH、HD是 Anammox菌特有的代谢酶。由于Anammox菌会分泌大量的胞外聚合物，这就使分离纯化Anammox菌代谢酶的困难加大。
2.2厌氧甲烷氧化反硝化过程
亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化过程机理由Ettwig团队提出，称为内部脱氮好氧甲烷氧化[6]：NO2-首先被亚硝酸盐还原酶还原为NO，经过一种未知NO歧化酶的作用将2分子NO催化生成N2和O2，生成的O2一部分用于甲烷氧化，甲烷经甲烷单加氧酶（pMMO）氧化为甲醇，后经一系列脱氢酶的作用，最终被氧化为CO2，剩余O2用于正常的呼吸作用（如图2所示）。
硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化过程机理由Haroon等[3]提出，通过逆向产甲烷途径耦合硝酸盐还原与甲烷的厌氧氧化（图3）。他们运用宏基因组、宏转录组和同位素分析手段证实Candidatus Methanoperedens Nitroreducens 通過反向产甲烷途径氧化甲烷，获得的电子用于硝酸盐的部分反硝化（硝酸盐转化为亚硝酸盐）。研究表明，Candidatus Methanoperedens Nitroreducens细胞内包含反向产甲烷过程所需的基因，可经过一系列酶促反应最终转化为CO2，释放电子供硝酸盐还原。同时，Candidatus Methanoperedens Nitroreducens中含有NO3-还原酶编码基因（Nar），可完成硝酸盐的部分反硝化（硝酸盐转化为亚硝酸盐）。
3展望
废水生物脱氮过程比较复杂，任何一个方面的突破都会带动其他方面的发展。新型厌氧脱氮微生物的发现将在一定程度上为新工艺的设计和发展提供良好的基础。然而，目前人们对此类微生物菌的研究还主要停留在实验室分离培养和生理生化特性探究阶段，部分微生物如厌氧甲烷氧化反硝化菌甚至还未得到高效的纯培养物。因此我们不但要研究现有新菌种的生物学特性，代谢机理，还要继续筛选高效微生物并对其进行快速扩大培养；在高效脱氮微生物研究的基础上简化老工艺，开发新工艺，并加速新型微生物工艺应用过程。如今对新型菌种的应用还比较少，但是从长远看，它必将替代传统的脱氮菌种得到广泛的应用。同样，随着现代生物学的进展，更多脱氮物种将会被发现。 參考文献：
[1]周英杰，王淑梅，张兆基，等.厌氧氨氧化菌的代谢途径及其关键酶的研究[J].生态学杂志.2012，31（3）：738-744.
[2]Raghoebarsing AA，Pol A，wande Pas-Schoonen KT，et al. A microbial consortium couples anaerobic methane oxidation to denitrification [J]. Nature，2006，440：918-920.
[3]Haroon Mohamed F.，Hu Shihu，Shi Ying，et al. Anaerobic oxidation of methane coupled to nitrate reduction in a novel archaeal lineage [J].Nature，2013：1-4.
[4]Van Niftrik L，Geert W J C，Van Donselaar E G，et al. Linking ultra structure and function in four genera of anaerobic ammonium oxidizing bacteria：cell plan，glycogen storage，and localization of cytochrome proteins [J]. J bacteriol，2008，190（2）：708- 717.
[5]Kostera J，Youngblut M，Slosarczyk J，et al. Kinetic and product distribution analysis of NO reductase activity in Nitrosomonas europaea hydroxylamine oxidoreductase. Journal of Biological Inorganic Chemistry.2008，13：1073-1083.
[6]Katharina F.Ettwig，Margaret K. Butler，Denis Le Paslier et al. Nitrite-driven anaerobic methane oxidation by oxygenic bacteria[J]. Nature，2010，464：543-548
enomics. Science，2004，305（5689）：1457-1462.
关键词：生物脱氮；厌氧氨氧化；甲烷氧化反硝化
近年来，氮素给环境造成的污染问题日益突出，其危害也日益受到人们的重视。有效降低废水中氮素浓度，已成为现代废水处理技术的一项新课题。在众多废水脱氮处理方法中，厌氧生物脱氮因其成本低廉、高效、无二次污染和易操作等优点，具有一定的发展前景。本文就新型厌氧脱氮微生物及工艺研究进展进行阐述。
1 新型厌氧脱氮微生物种类
1.1厌氧氨氧化菌
1995年Mulder等在进行反硝化小试研究时，发现了以NH4+为电子供体还原NO3-的厌氧氨氧化，该过程不需要外加碳源，能耗低。随后，Anammox 菌得到了深入的研究。至今为止，共发现10种Anammox菌，分别是Candidatus“Brocadia anammoxidans”、Candidatus Scalindua sorokinii、Candidatus Scalindua wagneri、Candidatus Scalindua brodae、Candidatus Brocadia fulgida、Candidatus Anammoxoglobus propionicus、Candidatus Jettenia asiatica、Candidatus Scalindua Arabica、Candidatus Brocadia sinica。它们均属于浮霉状菌目（Planctomycetes）[1]。
1.2厌氧甲烷氧化反硝化菌
厌氧甲烷氧化反硝化过程分为亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化和硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化。Raghoebarsing等（2009）[2]富集了获得亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化菌，并通过FISH、脂质分析及16S rRNA基因检测确定该类菌隶属于细菌，NC10门，可独立完成厌氧甲烷氧化反硝化过程，随后，该细菌被命名为“Candidatus Methylmirabilis oxyfera”。Haroon等（2013）[3]首次富集到硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化菌，进一步运用宏基因组、宏转录组和同位素分析方法证实可完成此过程的古菌属于ANME-2d，将其命名为“Candidatus Methanoperedens Nitroreducens”。
2厌氧微生物脱氮机制
2.1厌氧氨氧化过程
厌氧氨氧化（Anammox） 是指在厌氧条件下，氨以亚硝酸盐为电子受体直接被氧化为氮气的生物反应。Vande Graff等在1997年用15N示踪法研究并构建了厌氧氨氧化的代谢模型[4]。该代谢过程（图1）是在多种酶的催化下完成的，主要包括亚硝酸盐还原酶（Nir）、硝酸盐还原酶 （ Nar ）、羟胺氧化还原酶（ HAO ）、联氨氧化酶（ HZO）、联氨水解酶（ HH）、联氨脱氢酶（ HD）等。Nir、Nar、HAO在好氧氨氧化细菌和反硝化细菌中均能发现，但在好氧氨氧化细菌和反硝化细菌中的HAO与Anammox菌中的HAO功能有差异。前者能将NO转化为羟胺 [5]，同时也能将羟胺转化为亚硝酸；后者能将羟胺转化为 NO，并且能催化氧化联氨。HZO、HH、HD是 Anammox菌特有的代谢酶。由于Anammox菌会分泌大量的胞外聚合物，这就使分离纯化Anammox菌代谢酶的困难加大。
2.2厌氧甲烷氧化反硝化过程
亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化过程机理由Ettwig团队提出，称为内部脱氮好氧甲烷氧化[6]：NO2-首先被亚硝酸盐还原酶还原为NO，经过一种未知NO歧化酶的作用将2分子NO催化生成N2和O2，生成的O2一部分用于甲烷氧化，甲烷经甲烷单加氧酶（pMMO）氧化为甲醇，后经一系列脱氢酶的作用，最终被氧化为CO2，剩余O2用于正常的呼吸作用（如图2所示）。
硝酸盐型厌氧甲烷氧化反硝化过程机理由Haroon等[3]提出，通过逆向产甲烷途径耦合硝酸盐还原与甲烷的厌氧氧化（图3）。他们运用宏基因组、宏转录组和同位素分析手段证实Candidatus Methanoperedens Nitroreducens 通過反向产甲烷途径氧化甲烷，获得的电子用于硝酸盐的部分反硝化（硝酸盐转化为亚硝酸盐）。研究表明，Candidatus Methanoperedens Nitroreducens细胞内包含反向产甲烷过程所需的基因，可经过一系列酶促反应最终转化为CO2，释放电子供硝酸盐还原。同时，Candidatus Methanoperedens Nitroreducens中含有NO3-还原酶编码基因（Nar），可完成硝酸盐的部分反硝化（硝酸盐转化为亚硝酸盐）。
3展望
废水生物脱氮过程比较复杂，任何一个方面的突破都会带动其他方面的发展。新型厌氧脱氮微生物的发现将在一定程度上为新工艺的设计和发展提供良好的基础。然而，目前人们对此类微生物菌的研究还主要停留在实验室分离培养和生理生化特性探究阶段，部分微生物如厌氧甲烷氧化反硝化菌甚至还未得到高效的纯培养物。因此我们不但要研究现有新菌种的生物学特性，代谢机理，还要继续筛选高效微生物并对其进行快速扩大培养；在高效脱氮微生物研究的基础上简化老工艺，开发新工艺，并加速新型微生物工艺应用过程。如今对新型菌种的应用还比较少，但是从长远看，它必将替代传统的脱氮菌种得到广泛的应用。同样，随着现代生物学的进展，更多脱氮物种将会被发现。 參考文献：
[1]周英杰，王淑梅，张兆基，等.厌氧氨氧化菌的代谢途径及其关键酶的研究[J].生态学杂志.2012，31（3）：738-744.
[2]Raghoebarsing AA，Pol A，wande Pas-Schoonen KT，et al. A microbial consortium couples anaerobic methane oxidation to denitrification [J]. Nature，2006，440：918-920.
[3]Haroon Mohamed F.，Hu Shihu，Shi Ying，et al. Anaerobic oxidation of methane coupled to nitrate reduction in a novel archaeal lineage [J].Nature，2013：1-4.
[4]Van Niftrik L，Geert W J C，Van Donselaar E G，et al. Linking ultra structure and function in four genera of anaerobic ammonium oxidizing bacteria：cell plan，glycogen storage，and localization of cytochrome proteins [J]. J bacteriol，2008，190（2）：708- 717.
[5]Kostera J，Youngblut M，Slosarczyk J，et al. Kinetic and product distribution analysis of NO reductase activity in Nitrosomonas europaea hydroxylamine oxidoreductase. Journal of Biological Inorganic Chemistry.2008，13：1073-1083.
[6]Katharina F.Ettwig，Margaret K. Butler，Denis Le Paslier et al. Nitrite-driven anaerobic methane oxidation by oxygenic bacteria[J]. Nature，2010，464：543-548
enomics. Science，2004，305（5689）：1457-1462.