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[摘要] 目的 探讨CYP2C19基因多态性对氯吡格雷治疗急性脑梗死的疗效影响。 方法 选取2015年12月～2016年12月我院收治的210例急性腦梗死患者，所有患者均给予氯吡格雷进行治疗2周，根据CYP2C19基因型分析结果，将其分为快代谢组（n=61）、中代谢组（n=121）和慢代谢组（n=28），计算服药前及服药后1 d、5 d各组的血小板聚集抑制率并进行分析，并于服药前及服药后7 d、14 d进行NIHSS和日常生活活动能力评价（ADL）评分，同时采用多元素Logistic回归分析法分析影响血小板聚集抑制率的因素。 结果 各组服药后1 d、5 d血小板聚集抑制率均较服药前显著降低（P<0.05），但快代谢组服药后1 d、5 d血小板聚集抑制率显著低于中代谢组和慢代谢组（P<0.05）。各组服药后7 d、14 d NIHSS评分均较服药前显著降低（P<0.05），ADL评分均较服药前升高，但快代谢组服药后7 d、14 d NIHSS评分显著低于中代谢组和慢代谢组（P<0.05），ADL评分显著性高于中代谢组和慢代谢组（P<0.05）。对年龄、性别、吸烟、饮酒、体重指数、高血压、糖尿病、高脂血症、CYP2C19基因多态性进行多因素Logistic回归分析，结果显示CYP2C19基因多态性是影响氯吡格雷血小板聚集抑制率的影响因素（P<0.05）。结论 CYP2C19 基因多态性可影响氯吡格雷的临床疗效，其中携带有等位基因*2和/（或）*3对氯吡格雷疗效有负面的影响。
[关键词] CYP2C19基因多态性；氯吡格雷；急性脑梗死；疗效
[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）23-0006-04
[Abstract] Objective To investigate the curative effects of CYP2C19 gene polymorphism on clopidogrel in the treatment of acute cerebral infarction. Methods From December 2015 to December 2016 in our hospital，210 cases of patients with acute cerebral infarction having 2 weeks of clopidogrel treatment were chosen and divided into the fast metabolism group （n=61）， the middle metabolism group （n=121） and the slow metabolism group （n=28）. Before treatment and 1 d， 5 d after treatment， according to the CYP2C19 genotype analysis results， the inhibition of platelet aggregation and analysis， evaluation of NIHSS and the activities of daily life （ADL） were recorded and compared； Logistic multi element regression analysis method were used to analyze blood agglutination inhibition rate. Results 1 d and 5 d after taking medicine， the inhibition rates of platelet aggregation in all groups were significantly lower than that before the treatment（P<0.05）， which in the fast metabolism group was lower than that in the middle metabolism group and the slow metabolism group（P<0.05）. 7 d， 14 d after treatment， NIHSS scores were significantly lower than those before treatment（P<0.05）， ADL scores were increased compared with before taking medicine，but sooner after taking medicine. 7 d， 14 d in the fast metabolism group NIHSS score was significantly lower than that in the middle metabolism group and the slow metabolism group（P<0.05）； While ADL score was significantly higher than that in the middle metabolism group and the slow metabolism group（P<0.05）. The logistic regression analysis ressults of age， sex， smoking， drinking， BMI， hypertension，diabetes，hyperlipidemia and CYP2C19 gene polymorphism showed that CYP2C19 gene polymorphism was the influencing factors of clopidogrel platelet aggregation inhibition rate（P<0.05）. Conclusion Polymorphisms in the CYP2C19 gene could affect the clinical efficacy of clopidogrel， with allele *2 and/or *3 having a negative effect on clopidogrel efficacy. [Key words] CYP2C19 gene polymorphism； Clopidogrel； Acute cerebral infarction； Curative effect
急性脑梗死是常见的急性脑血管疾病，具有发病率高、致残率高、死亡率高及复发率高的特点，使其成为临床工作中最为棘手的问题之一，给家庭和社会带来严重的负担[1]。中国急性缺血性脑卒中诊治指南推荐[2]：对不能进行溶栓治疗的患者应尽早开始抗血小板治疗；而应用溶栓治疗的患者，在溶栓治疗 24 h后如无出血等禁忌证，亦应尽早开始抗血小板治疗，这就使得抗血小板治疗成为神经病学界在脑血管病治疗研究中的另一热点。氯吡格雷是临床上常用的抗血小板药物，某些患者经过标准氯吡格雷治疗后，仍不能避免缺血性事件的发生，被称之为氯吡格雷抵抗。其原因可能是因为氯吡格雷是一种前体药物，本身并无抗血小板作用，服药吸收后需要在肝脏经细胞色素P450酶代谢转化成活性的产物，其活性代谢产物选择性地、不可逆地与血小板表面受体 P2Y12 结合，从而发挥抗血小板活性的作用，因此氯吡格雷抵抗可能与转运体、药物代谢酶、受体的基因多态性有关[3]。本研究探讨CYP2C19基因多态性对氯吡格雷治疗急性脑梗死的疗效影响，以便为临床用药提供指导。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2015年12月～2016年12月我院收治的210例急性脑梗死患者，所有患者均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》的诊断标准[2]，经CT或MRI 以明确诊断。纳入标准：病程<2周；不存在氯吡格雷禁忌证；入组前4周均未服用过氯吡格雷；对本研究知情，并签署知情同意书。排除标准：颅内出血者及有活动性出血、出血体质、出血倾向及血液疾病的患者；存在凝血功能障碍及系统性出血者；发病前2 周使用GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂；合并严重心、肝、肾功能障碍；肿瘤及免疫系统疾病；近2周内有手术史； 发病后有感染迹象者；慢性炎症性疾病者；正在参与其他临床研究者。根据CYP2C19基因型分析结果，将其分为快代谢组（n=61）、中代谢组（n=121）和慢代谢组（n=28）。三组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。所有患者予氯吡格雷（国药准字J20130083，赛诺菲安万特杭州制药有限公司，75 mg×7片/盒）口服治療，首次口服氯吡格雷300 mg，第2天起75 mg/d，连续14 d。
1.2 CYP2C19 基因多态性检测方法
采用限制性片段长度多态性PCR法检测。静脉抽取空腹肘静脉血于EDTA抗凝管中，按DNA提取试剂盒（美国Promeg）说明提取 DNA，采用聚 PCR-RFLP法进行基因型检测。具体步骤如下：待测目的DNA片段进行 PCR 扩增，随后采用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析目的DNA片段是否被切割而分型。本研究检测人基因组CYP2C19基因两个位点：即*2G681A和*3G636A，其基因型分为：野生型（*1/*1）、突变杂合型（*1/*2，*1/*3）和突变纯合型（*2/*2，*2/*3，*3/*3）。不同基因型的人群间氯吡格雷的药物代谢动力学特征存在较大的差异，其中携带野生型基因（*1/*1）归为快代谢型，突变杂合型（*1/*2，*1/*3）为中间代谢型，突变纯合型（*2/*2，*2/*3，*3/*3）为慢代谢型。
1.3 观察指标
（1）计算服药后1 d及5 d各组的血小板聚集抑制率并进行分析；（2）服药前及服药后7 d、14 d采用美国国立卫生院神经功能缺损评分（NIHSS）对两组患者的神经功能进行评分[4]，采用日常生活能力量表（ADL）对两组患者的生活质量进行评分[5]。（3）对年龄、性别、吸烟、饮酒、体重指数、高血压、糖尿病、高脂血症、CYP2C19基因多态性进行多因素Logistic回归分析，分析影响氯吡格雷血小板聚集抑制率的影响因素。
1.4 血小板聚集抑制率测定方法
用5000型TEG凝血分析仪（美Haemoscope 公司）进行分析，采用 TEG 凝血分析仪进行检查，利用 TEG 软件根据测试结果自动计算出最大振幅（MA）。通道1 MA代表由凝血酶诱导的血凝块（MAth），通道2 MA代表缺少凝血酶和血小板激活的状态下的纤维蛋白网的强度（MAfib），通道3 MA和通道4 MA代表纤维蛋白网和被激活剂激活的血小板所形成的血凝块的强度（MAAA或MAADP）。通过公式计算血小板聚集抑制率：抑制率（%）=（MAADP-MAfib）/MAfib-Math）×100%[6]。
1.5 统计学处理
采用SPSS 13.0统计学软件包进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用F检验，两组间均数比较采用两独立样本t检验。率的比较采用χ2检验。影响因素分析采用多因素Logistic回归分析法。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组血小板聚集抑制率比较
各组服药前血小板聚集抑制率比较差异无统计学意义（P>0.05）；各组服药后1 d、5 d血小板聚集抑制率均较服药前显著降低（P<0.05），服药后1 d、5 d三组的血小板聚集抑制率比较差异具有统计学意义（P<0.05）；但快代谢组服药后1 d、5 d血小板聚集抑制率显著低于中代谢组和慢代谢组（P<0.05）。见表2。
2.2 三组治疗前后NIHSS评分及ADL评分比较
各组服药前NIHSS评分及ADL评分比较差异无统计学意义（P>0.05）；各组服药后7 d、14 d NIHSS评分均较服药前显著降低（P<0.05），ADL评分均较服药前升高；服药后7 d、14 d NIHSS评分及ADL评分三组比较差异具有统计学意义（P<0.05），但快代谢组服药后7 d、14 d NIHSS评分显著低于中代谢组和慢代谢组（P<0.05），ADL评分显著性高于中代谢组和慢代谢组（P<0.05）。见表3。 2.3 影响血小板聚集抑制率的相关影响因素Logistic分析
对年龄、性别、吸烟、饮酒、体重指数、高血压、糖尿病、高脂血症、CYP2C19基因多态性进行多因素Logistic回归分析，结果显示CYP2C19基因多态性是影响氯吡格雷血小板聚集抑制率的影响因素（P<0.05）。见表4。
3 讨论
氯吡格雷是一种重要的抗血小板药物，在临床上氯吡格雷抗血小板的作用存在较大的个体差异，主要原因是口服吸收后需要转化为活性代谢产物才能发挥作用，而体内转化受多种G蛋白偶联受体及酶的影响，其中CYP450 酶家族中的CYP2C19 编码的酶起主要作用，CYP2C19 基因的多态性对氯吡格雷代谢的影响越来越受重视，最为常见的基因型是 CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*3、*5、*6，特别是CYP2C19*2和*3基因型。CYP2C19*2基因型是CYP2C19基因的第5外显子在第681位的突变（681G/A），可造成外显子5’端40 bp碱基缺失，并改变之后的mRNA阅读框架，产生出一个无功能的蛋白CYP2C19*2酶。CYP2C19*3基因型是在第4外显子在第636位的突变（636G/A）造成终止码提前，产生出代谢功能极低的CYP2C19*3酶。这两个无功能或极低功能的代谢蛋白难以将氯吡格雷代谢为活性产物，严重影响氯吡格雷的抗血小板能力。未携带*2，*3的等位基因，编码的酶活性最高，即*1/*1，被定义为快代谢型（EM）；而携带两种无功能等位基因即*2/*3、*2/*2、*3/*3编码的酶的活性最低，被定义为慢代谢型（PM）。携带一种无功能等位基因即*1/*2或*1/*3编码的酶活性介于两者之间，被定义为中间代谢型（IM）。
本研究对CYP2C19基因多态性对氯吡格雷治疗急性脑梗死的疗效影响，结果显示快代谢组服药1 d、5 d的血小板聚集抑制率均显著性低于中代谢组和慢代谢组，快代谢组的NIHSS显著低于中代谢组和慢代谢组，ADL评分显著高于中代谢组和慢代谢组，提示带有等位基因*2和/（或）*3对氯吡格雷疗效有负面的影响，进一步对影响氯吡格雷的影响因素进行分析，结果显示CYP2C19基因多态性是影响氯吡格雷的影响因素。本研究从分子水平和整体水平评价氯吡格雷对于急性脑梗死患者的疗效，确立CYP2C19 基因多态性与氯吡格雷疗效的相关性，通过基因分型方法预测氯吡格雷的疗效，为氯吡格雷的用药提供遗传学理论指导，识别氯吡格雷弱代谢脑梗死患者提供敏感的、可信的预测指标，实现临床给药方案个体化。
综上所述，CYP2C19 基因多态性可影响氯吡格雷的临床疗效，其中携带有等位基因*2和/（或）*3对氯吡格雷疗效有负面的影响。
[参考文献]
[1] 陈淑霞. CYP2C19基因多态性、血小板中微小RNA-26a的表达水平与PCI患者术后氯吡格雷抵抗的关系及不同药物联用方式干预的治疗效果[D]. 河北医科大学，2016.
[2] 中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南撰写组. 中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010[J]. 中国全科医学，2011，14（35）：4013-4017.
[3] 邱丽娜. 缺血性脑卒中患者CYP2C19基因多态性、氯吡格雷抵抗与临床预后的相关性分析[D]. 天津医科大学，2015.
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[6] 李海蓬. CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抵抗相关性研究[D]. 天津医科大学，2013.
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[20] 贾冬梅. 基因多态性对氯吡格雷治疗急性脑梗死有效性影响的研究[D]. 南京医科大学，2013.
（收稿日期：2017-05-20）
[关键词] CYP2C19基因多态性；氯吡格雷；急性脑梗死；疗效
[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）23-0006-04
[Abstract] Objective To investigate the curative effects of CYP2C19 gene polymorphism on clopidogrel in the treatment of acute cerebral infarction. Methods From December 2015 to December 2016 in our hospital，210 cases of patients with acute cerebral infarction having 2 weeks of clopidogrel treatment were chosen and divided into the fast metabolism group （n=61）， the middle metabolism group （n=121） and the slow metabolism group （n=28）. Before treatment and 1 d， 5 d after treatment， according to the CYP2C19 genotype analysis results， the inhibition of platelet aggregation and analysis， evaluation of NIHSS and the activities of daily life （ADL） were recorded and compared； Logistic multi element regression analysis method were used to analyze blood agglutination inhibition rate. Results 1 d and 5 d after taking medicine， the inhibition rates of platelet aggregation in all groups were significantly lower than that before the treatment（P<0.05）， which in the fast metabolism group was lower than that in the middle metabolism group and the slow metabolism group（P<0.05）. 7 d， 14 d after treatment， NIHSS scores were significantly lower than those before treatment（P<0.05）， ADL scores were increased compared with before taking medicine，but sooner after taking medicine. 7 d， 14 d in the fast metabolism group NIHSS score was significantly lower than that in the middle metabolism group and the slow metabolism group（P<0.05）； While ADL score was significantly higher than that in the middle metabolism group and the slow metabolism group（P<0.05）. The logistic regression analysis ressults of age， sex， smoking， drinking， BMI， hypertension，diabetes，hyperlipidemia and CYP2C19 gene polymorphism showed that CYP2C19 gene polymorphism was the influencing factors of clopidogrel platelet aggregation inhibition rate（P<0.05）. Conclusion Polymorphisms in the CYP2C19 gene could affect the clinical efficacy of clopidogrel， with allele *2 and/or *3 having a negative effect on clopidogrel efficacy. [Key words] CYP2C19 gene polymorphism； Clopidogrel； Acute cerebral infarction； Curative effect
急性脑梗死是常见的急性脑血管疾病，具有发病率高、致残率高、死亡率高及复发率高的特点，使其成为临床工作中最为棘手的问题之一，给家庭和社会带来严重的负担[1]。中国急性缺血性脑卒中诊治指南推荐[2]：对不能进行溶栓治疗的患者应尽早开始抗血小板治疗；而应用溶栓治疗的患者，在溶栓治疗 24 h后如无出血等禁忌证，亦应尽早开始抗血小板治疗，这就使得抗血小板治疗成为神经病学界在脑血管病治疗研究中的另一热点。氯吡格雷是临床上常用的抗血小板药物，某些患者经过标准氯吡格雷治疗后，仍不能避免缺血性事件的发生，被称之为氯吡格雷抵抗。其原因可能是因为氯吡格雷是一种前体药物，本身并无抗血小板作用，服药吸收后需要在肝脏经细胞色素P450酶代谢转化成活性的产物，其活性代谢产物选择性地、不可逆地与血小板表面受体 P2Y12 结合，从而发挥抗血小板活性的作用，因此氯吡格雷抵抗可能与转运体、药物代谢酶、受体的基因多态性有关[3]。本研究探讨CYP2C19基因多态性对氯吡格雷治疗急性脑梗死的疗效影响，以便为临床用药提供指导。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2015年12月～2016年12月我院收治的210例急性脑梗死患者，所有患者均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》的诊断标准[2]，经CT或MRI 以明确诊断。纳入标准：病程<2周；不存在氯吡格雷禁忌证；入组前4周均未服用过氯吡格雷；对本研究知情，并签署知情同意书。排除标准：颅内出血者及有活动性出血、出血体质、出血倾向及血液疾病的患者；存在凝血功能障碍及系统性出血者；发病前2 周使用GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂；合并严重心、肝、肾功能障碍；肿瘤及免疫系统疾病；近2周内有手术史； 发病后有感染迹象者；慢性炎症性疾病者；正在参与其他临床研究者。根据CYP2C19基因型分析结果，将其分为快代谢组（n=61）、中代谢组（n=121）和慢代谢组（n=28）。三组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。所有患者予氯吡格雷（国药准字J20130083，赛诺菲安万特杭州制药有限公司，75 mg×7片/盒）口服治療，首次口服氯吡格雷300 mg，第2天起75 mg/d，连续14 d。
1.2 CYP2C19 基因多态性检测方法
采用限制性片段长度多态性PCR法检测。静脉抽取空腹肘静脉血于EDTA抗凝管中，按DNA提取试剂盒（美国Promeg）说明提取 DNA，采用聚 PCR-RFLP法进行基因型检测。具体步骤如下：待测目的DNA片段进行 PCR 扩增，随后采用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析目的DNA片段是否被切割而分型。本研究检测人基因组CYP2C19基因两个位点：即*2G681A和*3G636A，其基因型分为：野生型（*1/*1）、突变杂合型（*1/*2，*1/*3）和突变纯合型（*2/*2，*2/*3，*3/*3）。不同基因型的人群间氯吡格雷的药物代谢动力学特征存在较大的差异，其中携带野生型基因（*1/*1）归为快代谢型，突变杂合型（*1/*2，*1/*3）为中间代谢型，突变纯合型（*2/*2，*2/*3，*3/*3）为慢代谢型。
1.3 观察指标
（1）计算服药后1 d及5 d各组的血小板聚集抑制率并进行分析；（2）服药前及服药后7 d、14 d采用美国国立卫生院神经功能缺损评分（NIHSS）对两组患者的神经功能进行评分[4]，采用日常生活能力量表（ADL）对两组患者的生活质量进行评分[5]。（3）对年龄、性别、吸烟、饮酒、体重指数、高血压、糖尿病、高脂血症、CYP2C19基因多态性进行多因素Logistic回归分析，分析影响氯吡格雷血小板聚集抑制率的影响因素。
1.4 血小板聚集抑制率测定方法
用5000型TEG凝血分析仪（美Haemoscope 公司）进行分析，采用 TEG 凝血分析仪进行检查，利用 TEG 软件根据测试结果自动计算出最大振幅（MA）。通道1 MA代表由凝血酶诱导的血凝块（MAth），通道2 MA代表缺少凝血酶和血小板激活的状态下的纤维蛋白网的强度（MAfib），通道3 MA和通道4 MA代表纤维蛋白网和被激活剂激活的血小板所形成的血凝块的强度（MAAA或MAADP）。通过公式计算血小板聚集抑制率：抑制率（%）=（MAADP-MAfib）/MAfib-Math）×100%[6]。
1.5 统计学处理
采用SPSS 13.0统计学软件包进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用F检验，两组间均数比较采用两独立样本t检验。率的比较采用χ2检验。影响因素分析采用多因素Logistic回归分析法。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组血小板聚集抑制率比较
各组服药前血小板聚集抑制率比较差异无统计学意义（P>0.05）；各组服药后1 d、5 d血小板聚集抑制率均较服药前显著降低（P<0.05），服药后1 d、5 d三组的血小板聚集抑制率比较差异具有统计学意义（P<0.05）；但快代谢组服药后1 d、5 d血小板聚集抑制率显著低于中代谢组和慢代谢组（P<0.05）。见表2。
2.2 三组治疗前后NIHSS评分及ADL评分比较
各组服药前NIHSS评分及ADL评分比较差异无统计学意义（P>0.05）；各组服药后7 d、14 d NIHSS评分均较服药前显著降低（P<0.05），ADL评分均较服药前升高；服药后7 d、14 d NIHSS评分及ADL评分三组比较差异具有统计学意义（P<0.05），但快代谢组服药后7 d、14 d NIHSS评分显著低于中代谢组和慢代谢组（P<0.05），ADL评分显著性高于中代谢组和慢代谢组（P<0.05）。见表3。 2.3 影响血小板聚集抑制率的相关影响因素Logistic分析
对年龄、性别、吸烟、饮酒、体重指数、高血压、糖尿病、高脂血症、CYP2C19基因多态性进行多因素Logistic回归分析，结果显示CYP2C19基因多态性是影响氯吡格雷血小板聚集抑制率的影响因素（P<0.05）。见表4。
3 讨论
氯吡格雷是一种重要的抗血小板药物，在临床上氯吡格雷抗血小板的作用存在较大的个体差异，主要原因是口服吸收后需要转化为活性代谢产物才能发挥作用，而体内转化受多种G蛋白偶联受体及酶的影响，其中CYP450 酶家族中的CYP2C19 编码的酶起主要作用，CYP2C19 基因的多态性对氯吡格雷代谢的影响越来越受重视，最为常见的基因型是 CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*3、*5、*6，特别是CYP2C19*2和*3基因型。CYP2C19*2基因型是CYP2C19基因的第5外显子在第681位的突变（681G/A），可造成外显子5’端40 bp碱基缺失，并改变之后的mRNA阅读框架，产生出一个无功能的蛋白CYP2C19*2酶。CYP2C19*3基因型是在第4外显子在第636位的突变（636G/A）造成终止码提前，产生出代谢功能极低的CYP2C19*3酶。这两个无功能或极低功能的代谢蛋白难以将氯吡格雷代谢为活性产物，严重影响氯吡格雷的抗血小板能力。未携带*2，*3的等位基因，编码的酶活性最高，即*1/*1，被定义为快代谢型（EM）；而携带两种无功能等位基因即*2/*3、*2/*2、*3/*3编码的酶的活性最低，被定义为慢代谢型（PM）。携带一种无功能等位基因即*1/*2或*1/*3编码的酶活性介于两者之间，被定义为中间代谢型（IM）。
本研究对CYP2C19基因多态性对氯吡格雷治疗急性脑梗死的疗效影响，结果显示快代谢组服药1 d、5 d的血小板聚集抑制率均显著性低于中代谢组和慢代谢组，快代谢组的NIHSS显著低于中代谢组和慢代谢组，ADL评分显著高于中代谢组和慢代谢组，提示带有等位基因*2和/（或）*3对氯吡格雷疗效有负面的影响，进一步对影响氯吡格雷的影响因素进行分析，结果显示CYP2C19基因多态性是影响氯吡格雷的影响因素。本研究从分子水平和整体水平评价氯吡格雷对于急性脑梗死患者的疗效，确立CYP2C19 基因多态性与氯吡格雷疗效的相关性，通过基因分型方法预测氯吡格雷的疗效，为氯吡格雷的用药提供遗传学理论指导，识别氯吡格雷弱代谢脑梗死患者提供敏感的、可信的预测指标，实现临床给药方案个体化。
综上所述，CYP2C19 基因多态性可影响氯吡格雷的临床疗效，其中携带有等位基因*2和/（或）*3对氯吡格雷疗效有负面的影响。
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（收稿日期：2017-05-20）