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摘 要：以欧丽特菠菜叶片为试材，研究了菠菜叶片发育过程中3个时期叶片（幼叶、成熟叶、衰老叶）的抗坏血酸代谢变化及抗坏血酸含量与其相关酶活性的关系。结果表明：抗坏血酸（AsA）和氧化型抗坏血酸（DHA）含量的变化趋势与L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶（GalLDH）以及脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性的变化趋势基本一致，而与抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性变化呈此消彼长。同时单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、谷胱甘肽还原酶（GR）和还原型谷胱甘肽（GSH）有助于AsA的再生。说明通过增加GalLDH和再生酶活性能提高菠菜叶片AsA的含量，并延缓其衰老。
关键词：菠菜； 叶片； 抗坏血酸；循环； L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶
中图分类号：S636.101文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）03-0064-04
抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）是植物和大多数动物体内合成的一类己糖内酯化合物，是大多数生物体内重要的抗氧化剂和许多酶的辅因子，在生长发育中起着重要作用（Noctor & Foyer，1998）。在高等植物中，AsA除了通过AsA-GSH循环系统再生外，还可以自身合成。脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR） 、抗坏血酸过氧化物酶（APX）及谷胱甘肽还原酶（GR） 是参与AsA-GSH循环的主要酶。而L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶（GalLDH）是AsA自身合成主要途径即L-半乳糖途径中直接催化半乳糖内酯的关键酶。关于植物发育过程中AsA通过AsA-GSH循环再生及合成的研究，国内外系统报告尚少。本试验以菠菜品种欧丽特的叶片为试材，探讨了菠菜叶片发育过程中AsA-GSH循环及AsA合成关键酶GalLDH活性的变化，以明确菠菜叶片发育对抗坏血代谢的影响及抗坏血酸含量与其相关酶活性的关系，为调控菠菜的AsA含量的栽培和育种，延缓菠菜衰老提供理论依据。
1 材料与方法1.1 试验材料
以菠菜欧丽特（Spinacia oleracea L.）叶片为试材，2012年3月下旬种植于聊城市农业科学研究院试验基地，于4月下旬随机采取菠菜发育过程中3个时期的叶片（幼叶为出苗后第30天，新长成的4片叶；成熟叶为出苗后第40天，由内向外第3～5片叶；衰老叶为出苗后第50天，由内向外第5～7片叶）若干，用液氮处理并保存于-80℃待用。每个样品在田间分别随机3点取样。
1.2 测定指标及研究方法
1.2.1 还原型抗坏血酸（AsA）和氧化型抗坏血酸（DHA）测定 参考Turcsanyi等及Takahama和Oniki提供的方法并做适当改进[3，4]。
1.2.2 还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）测定 参考Michael等提供的方法。
1.2.3 L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶（GalLDH）活性的测定 参照Tabata等（2001）[5]的方法并做适当改进。1个酶活性单位定义为每分钟氧化1 nmol L-半乳糖内酯（相当于还原2 nmol 细胞色素C）所需的酶液量，并把它换算用U/gFW表示。其中摩尔系数值为17.3 L/（mol·cm），用于酶活性计算。
1.2.4 DHAR、MDHAR和APX活性的测定 参考Stasolla和Yeung提供的方法[6]。DHAR 1个酶活性单位（U/gFW）定义为每克鲜重每分钟还原1 μmol DHA；MDHAR 1个酶活性单位（U/gFW）定义为每克鲜重每分钟氧化1 μmol NADH；APX 1个酶活性单位（U/gFW）定义为每克鲜重每分钟氧化1 μmol AsA。
1.2.5 谷胱甘肽还原酶（GR）活性的测定 按Knorzer 等（1996）[7]的方法，这是基于NADPH 氧化后在340 nm 处的吸光度的减少来衡量酶活性大小的方法。
各项指标重复测定3次。
2 结果与分析
2.1 菠菜叶片发育过程中AsA、DHA、AsA+DHA含量和AsA/DHA比值的变化
由图1可以看出，在幼叶、成熟叶和衰老叶中AsA、DHA和AsA+DHA含量差异显著。AsA和AsA+DHA含量随着叶片的发育逐渐升高，至叶片成熟后，随叶片的衰老显著降低，呈先升高后降低趋势。而DHA含量在叶片发育进程中一直呈降低趋势。
由图2看出，菠菜叶片发育过程中AsA/DHA比值先升高后降低。在叶片成熟以前升高，成熟后随着叶片的衰老AsA/DHA比值显著降低。说明AsA氧化还原状态与叶片的衰老密切相关。
2.2 菠菜叶片发育过程中GSH、GSSG、总谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量和GSH/GSSG比值的变化
GSH是植物体内一个重要的抗氧化剂和氧化还原势的调节剂，作为DHA的电子供体，其氧化还原态是通过AsA-GSH循环来与AsA联系[8]。由图3看出，菠菜叶片中GSH含量随着其生长进程逐渐降低，在幼叶含量最高，在衰老叶含量最低；GSSG先升高后降低，在成熟叶中含量最高，成熟后随着叶片的衰老GSSG含量显著降低；总谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量先升高后降低，在成熟叶中含量最高，在衰老叶中显著降低。
反映谷胱甘肽氧化还原状态的GSH/GSSG比值在幼叶中最高，随着叶片的生长显著降低，到衰老时又有所升高（图4）。
关键词：菠菜； 叶片； 抗坏血酸；循环； L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶
中图分类号：S636.101文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）03-0064-04
抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）是植物和大多数动物体内合成的一类己糖内酯化合物，是大多数生物体内重要的抗氧化剂和许多酶的辅因子，在生长发育中起着重要作用（Noctor & Foyer，1998）。在高等植物中，AsA除了通过AsA-GSH循环系统再生外，还可以自身合成。脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR） 、抗坏血酸过氧化物酶（APX）及谷胱甘肽还原酶（GR） 是参与AsA-GSH循环的主要酶。而L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶（GalLDH）是AsA自身合成主要途径即L-半乳糖途径中直接催化半乳糖内酯的关键酶。关于植物发育过程中AsA通过AsA-GSH循环再生及合成的研究，国内外系统报告尚少。本试验以菠菜品种欧丽特的叶片为试材，探讨了菠菜叶片发育过程中AsA-GSH循环及AsA合成关键酶GalLDH活性的变化，以明确菠菜叶片发育对抗坏血代谢的影响及抗坏血酸含量与其相关酶活性的关系，为调控菠菜的AsA含量的栽培和育种，延缓菠菜衰老提供理论依据。
1 材料与方法1.1 试验材料
以菠菜欧丽特（Spinacia oleracea L.）叶片为试材，2012年3月下旬种植于聊城市农业科学研究院试验基地，于4月下旬随机采取菠菜发育过程中3个时期的叶片（幼叶为出苗后第30天，新长成的4片叶；成熟叶为出苗后第40天，由内向外第3～5片叶；衰老叶为出苗后第50天，由内向外第5～7片叶）若干，用液氮处理并保存于-80℃待用。每个样品在田间分别随机3点取样。
1.2 测定指标及研究方法
1.2.1 还原型抗坏血酸（AsA）和氧化型抗坏血酸（DHA）测定 参考Turcsanyi等及Takahama和Oniki提供的方法并做适当改进[3，4]。
1.2.2 还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）测定 参考Michael等提供的方法。
1.2.3 L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶（GalLDH）活性的测定 参照Tabata等（2001）[5]的方法并做适当改进。1个酶活性单位定义为每分钟氧化1 nmol L-半乳糖内酯（相当于还原2 nmol 细胞色素C）所需的酶液量，并把它换算用U/gFW表示。其中摩尔系数值为17.3 L/（mol·cm），用于酶活性计算。
1.2.4 DHAR、MDHAR和APX活性的测定 参考Stasolla和Yeung提供的方法[6]。DHAR 1个酶活性单位（U/gFW）定义为每克鲜重每分钟还原1 μmol DHA；MDHAR 1个酶活性单位（U/gFW）定义为每克鲜重每分钟氧化1 μmol NADH；APX 1个酶活性单位（U/gFW）定义为每克鲜重每分钟氧化1 μmol AsA。
1.2.5 谷胱甘肽还原酶（GR）活性的测定 按Knorzer 等（1996）[7]的方法，这是基于NADPH 氧化后在340 nm 处的吸光度的减少来衡量酶活性大小的方法。
各项指标重复测定3次。
2 结果与分析
2.1 菠菜叶片发育过程中AsA、DHA、AsA+DHA含量和AsA/DHA比值的变化
由图1可以看出，在幼叶、成熟叶和衰老叶中AsA、DHA和AsA+DHA含量差异显著。AsA和AsA+DHA含量随着叶片的发育逐渐升高，至叶片成熟后，随叶片的衰老显著降低，呈先升高后降低趋势。而DHA含量在叶片发育进程中一直呈降低趋势。
由图2看出，菠菜叶片发育过程中AsA/DHA比值先升高后降低。在叶片成熟以前升高，成熟后随着叶片的衰老AsA/DHA比值显著降低。说明AsA氧化还原状态与叶片的衰老密切相关。
2.2 菠菜叶片发育过程中GSH、GSSG、总谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量和GSH/GSSG比值的变化
GSH是植物体内一个重要的抗氧化剂和氧化还原势的调节剂，作为DHA的电子供体，其氧化还原态是通过AsA-GSH循环来与AsA联系[8]。由图3看出，菠菜叶片中GSH含量随着其生长进程逐渐降低，在幼叶含量最高，在衰老叶含量最低；GSSG先升高后降低，在成熟叶中含量最高，成熟后随着叶片的衰老GSSG含量显著降低；总谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量先升高后降低，在成熟叶中含量最高，在衰老叶中显著降低。
反映谷胱甘肽氧化还原状态的GSH/GSSG比值在幼叶中最高，随着叶片的生长显著降低，到衰老时又有所升高（图4）。