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【摘 要】 血小板微粒是血小板在激活或凋亡过程中释放的超微膜性囊泡，不仅是重要的促血栓和促炎症物质，还作为多种生物活性物质的载体介导生物信息在细胞间传递。血小板微粒参与免疫炎症及血管新生等方面的调控，在类风湿关节炎的发生、发展过程中发挥重要的作用，这有可能成为提高类风湿关节炎临床疗效的一个治疗靶点。文章主要针对血小板微粒与类风湿关节炎的相关性进行综述。
【关键词】 关节炎，类风湿；血小板微粒；PI3K/AKT通路；综述
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.06.017
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，主要表现为关节滑膜的慢性炎症，可引起关节疼痛、肿胀，并最终导致软骨和骨质破坏。其基本病理改变为滑膜炎、血管翳形成，伴有纤维沉淀、细胞增殖、分化、血小板的活化及纤溶系统的改变等，是一种致残率较高的疾病。RA病因与发病机制至今尚不完全清楚。现代分子免疫学研究发现，血小板不仅参与凝血过程，还广泛参与炎症反应[1-2]。大量研究显示，血小板活化后，在膜表面表达和释放多种活化产物即血小板微粒（platelet microparticles，PMPs），这些物质以不同方式参与了血小板-内皮细胞反应和血小板-白细胞反应，从而在炎症的发生、发展中发挥作用，促进RA滑膜细胞的增殖和血管的新生[3-6]。现就近年来有关PMPs与RA相关性研究作一综述。
1 PMPs
PMPs是血小板在激活状态下细胞膜伸展变形以出芽方式形成的微小囊泡，其直径< 1 μm。血小板膜上表达的40多种糖蛋白及许多活化标志物大多可在PMPs膜上表达，如GPIb、GPIa、GPIIa、GPIIb/IIIa、GPVI、血管性假性血友病因子（von Willebrand's disease factor，vWF）、血小板-内皮细胞黏附分子及蛋白质二硫化物异构酶、趋化因子受体等。循环中PMPs的含量反映了血小板的活化程度。有研究证实，PMPs不仅在人体血栓与止血、细胞的相互作用及人体免疫等过程中发挥着重要作用，还可以促进炎症的发生和血管新生，与RA的病理表现有着密切的关系。
2 PMPs与RA免疫炎症的发生
RA的基本病理特征是累及周身关节滑膜炎及血管翳形成。炎症形成过程中，T、B淋巴细胞，巨噬细胞，滑膜成纤维细胞等参与作用，细胞因子是参与免疫炎症反应的重要分子，PMPs携带血小板激活产生的大量生物活性物质，而这些物质是体内促炎症分子的主要来源。分化抗原CD40配体（cluster of differentiation 40 ligand，CD40L）可通过活化单核巨噬细胞分泌趋化因子，使巨噬细胞聚集在滑膜组织，促进炎症的发生，而循环中可溶性的CD40L大部分来源于血小板及其微粒，因此，PMPs具有显著的促炎症作用[7]。另外，体外凋亡产生的PMPs可以与单核细胞结合，诱导其在纤维粘连蛋白表面黏附并向M2亚型转化，进而成为巨噬细胞发挥致炎作用[8]。研究表明，在风湿性关节炎患者的关节滑膜液中存在PMPs，并且它可以释放白细胞介素（IL）-1，导致关节滑膜液中的成纤维细胞激活，从而促进关节炎症的发生。而耗竭血小板可以减轻鼠的炎症性关节炎[9]。RA的发生过程中，PMPs一方面促进内皮细胞黏附分子的表达和细胞因子的释放，从而刺激中性粒细胞受体的表达，一方面通过磷脂酶A2对自身磷脂的分解产生潜在促炎介质花生四烯酸；另一方面通过暴露活化的肿瘤坏死因子（TNF）-α转化酶来增加TNF-α的释放，并且加强其受体的裂解防止TNF-α灭
活[10]，从而进一步促进关节炎症，导致软骨和骨破坏。Boilard等[11]发现，RA的成纤维样滑膜细胞能刺激血小板产生PMPs，PMPs能反过来促使成纤维样滑膜细胞产生多种炎症因子及趋化因子，包括IL-6、IL-8、IL-13、单核细胞趋化蛋白-1和巨噬细胞移动抑制因子等，PMPs通过IL-1激活成纤维样滑膜细胞，进而参与RA的发病。另外，Messer等[12]发现，RA和骨关节炎患者滑液中的微粒除了能分泌IL-6和IL-8之外，还能促进B细胞活化因子和胸腺基质淋巴细胞生成素及分泌性白细胞蛋白酶抑制剂的分泌，提示滑液中的微粒可能通过成纤维样滑膜细胞促进上述细胞因子的分泌，调节B细胞功能，进而在RA发病中发挥作用。Hsu等[10]检测了RA患者外周血中的血小板微粒发现，血小板衍微粒在RA组明显高于健康对照组，病情活动的RA组明显高于缓解的RA组，其水平还与DAS28评分呈正相关。Boilard等[11]发现，RA患者滑液中的血小板微粒明显高于骨关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎及痛风性关节炎患者，且RA患者滑液中大部分的微粒来源于活化的血小板。
3 PMPs与RA血管翳的形成
RA滑膜组织是一种具有很强侵蚀作用的、类肿瘤样生长的病变组织。血管翳是RA病变过程中的一个特征性病理产物，新生血管的出现是维持和形成血管翳的一个重要因素[13]，而血管生成是一个由促血管生成和抑血管生成因子调控的复杂过程。血管形成过程中，内皮细胞是其主要的骨架结构，而PMPs可以促进内皮细胞的归巢，使内皮细胞在血管形成部位增殖、生存、迁移及管腔样结构形成，从而诱导血管生成。在内皮祖细胞培养物中检测到PMPs，提示PMPs可以诱导外周血单核细胞向内皮祖细胞转化[14]。将PMPs注射在心肌梗死部位，新血管形成的数量明显增加[15]。PMPs表面存在的蛋白质二硫化物异构酶具有催化活性，可参与隐蔽性组织因子的活化，并且作为血管损伤信号，从而触发纤维蛋白的形成[16]。Mause等[17]研究发现，PMPs可增加成血管早期生长细胞结合修复损伤内皮的潜能。另外，从动脉粥样硬化患者的斑块中分离的PMPs可增加血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的产生和新血管的形成[18]。VEGF已被确认是血管新生过程中的核心分子。王聪华等[19]研究发现，15例RA滑膜中均存在不同程度的VEGF表达，其中阳性7例，强阳性8例，表达VEGF的细胞主要为成纤维样滑膜细胞、微血管周围成纤维样细胞及血管平滑肌细胞，在表达VEGF的阳性细胞中，成纤维样滑膜细胞表达阳性率平均为48%，微血管周围的成纤维样细胞表达阳性率平均为34%，血管平滑肌细胞表达阳性率平均为11%。 4 PI3K/AKT通路——PMPs与RA
血小板源生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是一种重要的促细胞分裂剂，在生理状态下，PDGF以α颗粒的形式储存于血小板中；病理状态下，血小板活化，释放PMPs，分泌PDGF，PDGF可通过诱导血管平滑肌细胞（VSMC）表达可溶性血管黏附因子（sVCAM）-1，提高单核细胞与VSMC的黏附，即通过促进sVCAM-l的表达，参与损伤后的炎症反应的发生，对炎症细胞吸引和募集，还可在IL-1α、核转录因子（NF-κB）的协同下上调成纤维细胞合成分泌基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-3促进滑膜新生血管的形成，从而形成滑膜血管翳[20]。PDGF还可通过与其特异性受体结合激活多种信号通路如促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）等调节平滑肌细胞的增殖、迁移和凋亡。其中，PI3K/AKT信号通路中PI3K被激活后，使Akt磷酸化，它可通过一氧化氮合酶（NOS）-3加速NO合成，刺激可溶性鸟苷酸环化酶促进cGMP升高和cGMP依赖的蛋白激酶G活化，从而导致血小板颗粒分泌和血小板聚集的第2个高峰[21]。从而在RA的发生、发展中起着非常重要的作用。其可能的作用主要包括以下几个方面：①PI3K/AKT信号通路一方面可提高上调缺氧诱导因子（HIF）-α，激活NF-κB，从而促进VEGF及其他血管生成因子的表达和分泌[22-23]；另一方面激活c-Jun/AP-1蛋白偶联并结合到环氧合酶-2启动子的相应位点上，促进前列腺素E2（PGE2）的生物合成和释放，从而促使VEGF合成分泌，最终加强血管内皮细胞的活力并加速血管形成[24-25]。②AKT活化后可激活内皮型一氧化氮合酶（eNOS），并产生NO，NO可刺激血管舒张和促进血管生成[26]；PI3K/AKT信号通路无论在生理性还是病理性血管生成的过程中均发挥重要作用[27]，Cheng等[28]发现，小鸡胚胎中过度表达的PI3K或AKT可促进新血管广泛生成并增大已存在的血管，然而人第10号染色体缺失的磷酸酶（PTEN）的过度表达则可抑制这种效应，PTEN是一个作用于酪氨酸残基的去磷酸化蛋白[29]，是PI3K/AKT信号通路的主要负性调节蛋白，其主要功能是使第二信使PIP3脱磷酸化，从而拮抗PI3K/AKT通路的活化[30]。PTEN能有效抑制PI3K/AKT通路致使血管形成受抑制[31]。③PI3K/AKT信号通路激活后，引起哺乳动物雷帕霉素靶向蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）及其两个特殊酶作用底物的磷酸化，诱导B淋巴细胞的增殖[32-33]，分泌促炎症细胞因子、产生自身抗体、活化T淋巴细胞，促进T淋巴细胞浸润滑膜组织，从而参与RA滑膜炎。④PI3K/Akt/mTOR信号通路可上调Bcl-2家族成员，诱导抗凋亡蛋白Bcl-xL表达，抑制促凋亡蛋白，削弱凋亡，参与RA发病过程。⑤转化生长因子（TGF）-β可通过EGFR/PI3K/Akt信号通路在转录水平上抑制TG相互作用因子的表达，从而促转录细胞凋亡[34]。⑥细胞自噬是细胞利用溶酶体降解自身一些受损的细胞器和大分子物质过程，主要通过对长寿命蛋白及细胞器的降解和再利用，对细胞进行调节[35-36]；而mTOR属于PI3K蛋白激酶类家族，也是PI3K信号通路下游分子之一，作为自噬启动阶段关键调节因子，其活化后可抑制自噬的发生[37]。
5 小 结
综上所述，血小板活化及其释放的血小板微粒在RA病理变化中具有重要意义，然而研究证实，PI3K/AKT信号通路是血小板微粒释放反应的重要机制，也是血小板“内-外”信号传递的主要通路，调整血小板活化中PI3K/AKT信号通路活性有望成为减轻RA滑膜炎症、抑制血管翳形成及骨质破坏的一个治疗靶点[38]。因此，深入研究RA血小板活化释放血小板微粒过程中PI3K/AKT信号通路的改变，在更深层次上研究其发病的分子学机制，从而为提高RA的临床疗效提供有益的途径。
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收稿日期：2015-03-12；修回日期：2015-04-22
【关键词】 关节炎，类风湿；血小板微粒；PI3K/AKT通路；综述
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.06.017
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，主要表现为关节滑膜的慢性炎症，可引起关节疼痛、肿胀，并最终导致软骨和骨质破坏。其基本病理改变为滑膜炎、血管翳形成，伴有纤维沉淀、细胞增殖、分化、血小板的活化及纤溶系统的改变等，是一种致残率较高的疾病。RA病因与发病机制至今尚不完全清楚。现代分子免疫学研究发现，血小板不仅参与凝血过程，还广泛参与炎症反应[1-2]。大量研究显示，血小板活化后，在膜表面表达和释放多种活化产物即血小板微粒（platelet microparticles，PMPs），这些物质以不同方式参与了血小板-内皮细胞反应和血小板-白细胞反应，从而在炎症的发生、发展中发挥作用，促进RA滑膜细胞的增殖和血管的新生[3-6]。现就近年来有关PMPs与RA相关性研究作一综述。
1 PMPs
PMPs是血小板在激活状态下细胞膜伸展变形以出芽方式形成的微小囊泡，其直径< 1 μm。血小板膜上表达的40多种糖蛋白及许多活化标志物大多可在PMPs膜上表达，如GPIb、GPIa、GPIIa、GPIIb/IIIa、GPVI、血管性假性血友病因子（von Willebrand's disease factor，vWF）、血小板-内皮细胞黏附分子及蛋白质二硫化物异构酶、趋化因子受体等。循环中PMPs的含量反映了血小板的活化程度。有研究证实，PMPs不仅在人体血栓与止血、细胞的相互作用及人体免疫等过程中发挥着重要作用，还可以促进炎症的发生和血管新生，与RA的病理表现有着密切的关系。
2 PMPs与RA免疫炎症的发生
RA的基本病理特征是累及周身关节滑膜炎及血管翳形成。炎症形成过程中，T、B淋巴细胞，巨噬细胞，滑膜成纤维细胞等参与作用，细胞因子是参与免疫炎症反应的重要分子，PMPs携带血小板激活产生的大量生物活性物质，而这些物质是体内促炎症分子的主要来源。分化抗原CD40配体（cluster of differentiation 40 ligand，CD40L）可通过活化单核巨噬细胞分泌趋化因子，使巨噬细胞聚集在滑膜组织，促进炎症的发生，而循环中可溶性的CD40L大部分来源于血小板及其微粒，因此，PMPs具有显著的促炎症作用[7]。另外，体外凋亡产生的PMPs可以与单核细胞结合，诱导其在纤维粘连蛋白表面黏附并向M2亚型转化，进而成为巨噬细胞发挥致炎作用[8]。研究表明，在风湿性关节炎患者的关节滑膜液中存在PMPs，并且它可以释放白细胞介素（IL）-1，导致关节滑膜液中的成纤维细胞激活，从而促进关节炎症的发生。而耗竭血小板可以减轻鼠的炎症性关节炎[9]。RA的发生过程中，PMPs一方面促进内皮细胞黏附分子的表达和细胞因子的释放，从而刺激中性粒细胞受体的表达，一方面通过磷脂酶A2对自身磷脂的分解产生潜在促炎介质花生四烯酸；另一方面通过暴露活化的肿瘤坏死因子（TNF）-α转化酶来增加TNF-α的释放，并且加强其受体的裂解防止TNF-α灭
活[10]，从而进一步促进关节炎症，导致软骨和骨破坏。Boilard等[11]发现，RA的成纤维样滑膜细胞能刺激血小板产生PMPs，PMPs能反过来促使成纤维样滑膜细胞产生多种炎症因子及趋化因子，包括IL-6、IL-8、IL-13、单核细胞趋化蛋白-1和巨噬细胞移动抑制因子等，PMPs通过IL-1激活成纤维样滑膜细胞，进而参与RA的发病。另外，Messer等[12]发现，RA和骨关节炎患者滑液中的微粒除了能分泌IL-6和IL-8之外，还能促进B细胞活化因子和胸腺基质淋巴细胞生成素及分泌性白细胞蛋白酶抑制剂的分泌，提示滑液中的微粒可能通过成纤维样滑膜细胞促进上述细胞因子的分泌，调节B细胞功能，进而在RA发病中发挥作用。Hsu等[10]检测了RA患者外周血中的血小板微粒发现，血小板衍微粒在RA组明显高于健康对照组，病情活动的RA组明显高于缓解的RA组，其水平还与DAS28评分呈正相关。Boilard等[11]发现，RA患者滑液中的血小板微粒明显高于骨关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎及痛风性关节炎患者，且RA患者滑液中大部分的微粒来源于活化的血小板。
3 PMPs与RA血管翳的形成
RA滑膜组织是一种具有很强侵蚀作用的、类肿瘤样生长的病变组织。血管翳是RA病变过程中的一个特征性病理产物，新生血管的出现是维持和形成血管翳的一个重要因素[13]，而血管生成是一个由促血管生成和抑血管生成因子调控的复杂过程。血管形成过程中，内皮细胞是其主要的骨架结构，而PMPs可以促进内皮细胞的归巢，使内皮细胞在血管形成部位增殖、生存、迁移及管腔样结构形成，从而诱导血管生成。在内皮祖细胞培养物中检测到PMPs，提示PMPs可以诱导外周血单核细胞向内皮祖细胞转化[14]。将PMPs注射在心肌梗死部位，新血管形成的数量明显增加[15]。PMPs表面存在的蛋白质二硫化物异构酶具有催化活性，可参与隐蔽性组织因子的活化，并且作为血管损伤信号，从而触发纤维蛋白的形成[16]。Mause等[17]研究发现，PMPs可增加成血管早期生长细胞结合修复损伤内皮的潜能。另外，从动脉粥样硬化患者的斑块中分离的PMPs可增加血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的产生和新血管的形成[18]。VEGF已被确认是血管新生过程中的核心分子。王聪华等[19]研究发现，15例RA滑膜中均存在不同程度的VEGF表达，其中阳性7例，强阳性8例，表达VEGF的细胞主要为成纤维样滑膜细胞、微血管周围成纤维样细胞及血管平滑肌细胞，在表达VEGF的阳性细胞中，成纤维样滑膜细胞表达阳性率平均为48%，微血管周围的成纤维样细胞表达阳性率平均为34%，血管平滑肌细胞表达阳性率平均为11%。 4 PI3K/AKT通路——PMPs与RA
血小板源生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是一种重要的促细胞分裂剂，在生理状态下，PDGF以α颗粒的形式储存于血小板中；病理状态下，血小板活化，释放PMPs，分泌PDGF，PDGF可通过诱导血管平滑肌细胞（VSMC）表达可溶性血管黏附因子（sVCAM）-1，提高单核细胞与VSMC的黏附，即通过促进sVCAM-l的表达，参与损伤后的炎症反应的发生，对炎症细胞吸引和募集，还可在IL-1α、核转录因子（NF-κB）的协同下上调成纤维细胞合成分泌基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-3促进滑膜新生血管的形成，从而形成滑膜血管翳[20]。PDGF还可通过与其特异性受体结合激活多种信号通路如促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）等调节平滑肌细胞的增殖、迁移和凋亡。其中，PI3K/AKT信号通路中PI3K被激活后，使Akt磷酸化，它可通过一氧化氮合酶（NOS）-3加速NO合成，刺激可溶性鸟苷酸环化酶促进cGMP升高和cGMP依赖的蛋白激酶G活化，从而导致血小板颗粒分泌和血小板聚集的第2个高峰[21]。从而在RA的发生、发展中起着非常重要的作用。其可能的作用主要包括以下几个方面：①PI3K/AKT信号通路一方面可提高上调缺氧诱导因子（HIF）-α，激活NF-κB，从而促进VEGF及其他血管生成因子的表达和分泌[22-23]；另一方面激活c-Jun/AP-1蛋白偶联并结合到环氧合酶-2启动子的相应位点上，促进前列腺素E2（PGE2）的生物合成和释放，从而促使VEGF合成分泌，最终加强血管内皮细胞的活力并加速血管形成[24-25]。②AKT活化后可激活内皮型一氧化氮合酶（eNOS），并产生NO，NO可刺激血管舒张和促进血管生成[26]；PI3K/AKT信号通路无论在生理性还是病理性血管生成的过程中均发挥重要作用[27]，Cheng等[28]发现，小鸡胚胎中过度表达的PI3K或AKT可促进新血管广泛生成并增大已存在的血管，然而人第10号染色体缺失的磷酸酶（PTEN）的过度表达则可抑制这种效应，PTEN是一个作用于酪氨酸残基的去磷酸化蛋白[29]，是PI3K/AKT信号通路的主要负性调节蛋白，其主要功能是使第二信使PIP3脱磷酸化，从而拮抗PI3K/AKT通路的活化[30]。PTEN能有效抑制PI3K/AKT通路致使血管形成受抑制[31]。③PI3K/AKT信号通路激活后，引起哺乳动物雷帕霉素靶向蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）及其两个特殊酶作用底物的磷酸化，诱导B淋巴细胞的增殖[32-33]，分泌促炎症细胞因子、产生自身抗体、活化T淋巴细胞，促进T淋巴细胞浸润滑膜组织，从而参与RA滑膜炎。④PI3K/Akt/mTOR信号通路可上调Bcl-2家族成员，诱导抗凋亡蛋白Bcl-xL表达，抑制促凋亡蛋白，削弱凋亡，参与RA发病过程。⑤转化生长因子（TGF）-β可通过EGFR/PI3K/Akt信号通路在转录水平上抑制TG相互作用因子的表达，从而促转录细胞凋亡[34]。⑥细胞自噬是细胞利用溶酶体降解自身一些受损的细胞器和大分子物质过程，主要通过对长寿命蛋白及细胞器的降解和再利用，对细胞进行调节[35-36]；而mTOR属于PI3K蛋白激酶类家族，也是PI3K信号通路下游分子之一，作为自噬启动阶段关键调节因子，其活化后可抑制自噬的发生[37]。
5 小 结
综上所述，血小板活化及其释放的血小板微粒在RA病理变化中具有重要意义，然而研究证实，PI3K/AKT信号通路是血小板微粒释放反应的重要机制，也是血小板“内-外”信号传递的主要通路，调整血小板活化中PI3K/AKT信号通路活性有望成为减轻RA滑膜炎症、抑制血管翳形成及骨质破坏的一个治疗靶点[38]。因此，深入研究RA血小板活化释放血小板微粒过程中PI3K/AKT信号通路的改变，在更深层次上研究其发病的分子学机制，从而为提高RA的临床疗效提供有益的途径。
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收稿日期：2015-03-12；修回日期：2015-04-22