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摘要：目的：分析血小板捐献者采集前血小板计数假性减少的原因。方法 选取初筛结果PLT﹤150×109/L的标本，其中包含采血不顺利者，重新采集标本A管（EDTA-K2抗凝）、B管（枸橼酸抗凝抗凝），比较前后两次血细胞计数仪检测结果和手工计数检测结果；重新采集的A管（EDTA-K2抗凝）标本放置不同时间后检测，并比较放置不同时间后检测的结果和手工计数检测结果。结果：不同原因的假性血小板减少与复检结果有显著性差异。结论：血小板减少均应进行复检，为采集血小板提供准确可靠的数值。
关键词：血小板计数；血小板假性减少；血细胞分析仪
机采血小板捐献者采集前血小板计数的多少，对血小板的采集起决定性作用，出于对献血者保护的原则，血小板计数小于150×109/L的献血者不能捐献血小板。在实际工作中，有一部分可以达到捐献指标的献血者，由于操作原因使血小板计数假性减少，小于捐献指标，从而不能进行血小板的捐献，造成血液紧张，这是血站经常会遇到的问题，现就工作人员操作原因所致血小板假性减少进行简单的探讨。
对象与方法
1.一般资料
选取我站2012年9月到2013年3月机采血小板捐献者初筛血小板计数小于150×109/L 153例（均为EDTA-K2抗凝，其中采血不顺利者21例）。
2.方法
2.1主要仪器与试剂：
仪器：HORIBA ABX Pentra60血細胞分析仪、Olympus显微镜（仪器均于校准期内使用。）。
试剂：配套原装进口试剂（试剂均于有效期内使用）。
2.2实验：
2.2.1质量控制 本实验室参加卫生部临检中心室间质评，结果合格。实验前做室内质控，质控品为美德太平洋科技有限公司出品，结果在控。
2.2.2 对初筛血小板<150×109/L的153位血小板捐献者重新抽血，分别注入EDTA-K2抗凝管（A管）2ml和枸橼酸抗凝管（B管）2ml，充分混匀，按照第2版《全国临床检验操作规程》进行血小板血细胞分析仪计数（A、B管）；人工显微镜计数（B管），每个标本由2个人分别计数2次取平均值作为参考。10分钟内分别将初筛标本、复查标本A管和B管抗凝血涂血片经瑞氏染色显微镜观察。
2.2.3将EDTA-K2抗凝管（A管）室温放置，分别于采集后立即、采集后15～20min和采集后2h按照第2版《全国临床检验操作规程》进行血小板血细胞分析仪计数。
统计学方法：应用配对t检验进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义；应用q检验进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
应用配对t检验进行统计学处理，P<0.05，所有标本初筛结果与复查结果正常后和手工计数法结果相比差异有统计学意义（P<0.05）。
将153例血小板减少标本分为4组，即①抽血不当因素：第一次采集过程不顺利的21例PLT直方图出现无拟合曲线、翘尾等现象，镜下可见大量血小板凝块或小堆积，重新采集标本即复检A管和B管抗凝血涂片中均无成簇血小板，血小板散在分布，大小较为均一，标本无黄疽脂血等异常。②EDTA依赖性凝集组：两次采集过程均顺利，EDTA抗凝结果（初筛管、复检A管）均不正常，血片中有大量血小板聚集，一般为10个～20个血小板聚集成堆，更大的聚集有50个以上，而与之相对应的B管血涂片则无聚集血小板，血小板呈散在分布。③两次采集过程均顺利，镜检红细胞呈缗钱状排列，血小板成群或散在分布，数量正常，同时结合标本外观，试管内有许多沙粒样凝集颗粒，初检结果WBC、RBC、HB、HCT、MCV、MCHC、PLT等许多检测项目均异常，尤其是RBC数值很低，可考虑是冷凝集原因造成，标本经37℃水浴15 min后，上述现象消失，重新检测结果正常。④PLT直方图出现多峰、后峰翘起等，镜下血涂片中均无成簇血小板，血小板散在分布，血小板数量正常（每个油镜视野可见6～12个血小板），但是大血小板数量增多，体积接近小红细胞。
应用q检验进行统计学处理，采集后立即与采集后15～20min、手工法校正10min内对比组和采集后15～20min与手工法校正10min内对比组的P>0.05，表明对比组之间不具有显著性的差别；采集后2h标本与采集后立即、采集后15～20min、手工法校正10min内的对比组之间的P<0.05，表明对比组之间具有显著性的差别，因而认为标本放置超过20min后检测对检测结果有影响。
讨论
1.1标本采集过程的影响：静脉采血不顺利，抽血技术不熟练，难以做到一针见血，造成抽血时间延长，止血带使用时间超过3分钟，可引起血小板计数下降。因长时间捆扎止血带使静脉极度充盈、压力增高，可能会造成血管损伤或某些组织因子进入血液，也可能穿刺时相对肿胀的肢体内的组织因子进入注射器内，加快血液凝固。多次穿刺引起皮下出血，组织损伤，组织凝血因子混入血标本中产生肉眼看不见的小凝块，在这种情况下，血小板就出现假性减少，根据抽血不顺利的程度不同，也就造成血小板的数量出现假性减少的程度不一 [1]。
1.2标本质量的影响：
1.2.1.标本采集后处理：采血后立即颠倒混均8次，检测前混匀标本。若采血后混匀不及时、混匀不充分导致抗凝不充分而引起血小板聚集，血液凝固，严重影响血小板计数。
1.2.2抗凝剂EDTA的影响造成：按照国际血液学标准化委员会（ICSH）的建议，1.5～2.2mg的EDTA-K2抗凝1ml的全血可以抑制血小板聚集，从而达到抗凝的目的。但有极少数人的血小板在用EDTA抗凝时，反而会出现血小板聚集，这种EDTA依赖性假性血小板减少可能与血浆中存在的抗血小板抗体和/或抗心磷脂抗体等自身抗体有关，发生率约为0.2%，但无任何病理、生理意义，也与特殊药物使用无关。另一种现象是血小板粘附于白细胞上的“血小板卫星现象”，此现象与冷纤维蛋白原有关，或与血栓收缩蛋白有关，其机理是在EDTA的存在下，不仅包括来自血小板膜表面的GPⅡb/Ⅲa，而且包括IgG抗体直接与隐蔽抗原作用，其中包括来自血小板膜表面的GPⅡb/Ⅲa和来自成熟中性多核细胞的γ-Fc受体Ⅲ（CD16）的相互作用。发生率为1.2万分之一，与疾病和药物也无关。无论抗凝剂EDTA的影响，还是“血小板卫星现象”虽无任何病理、生理意义，但均可造成血小板假性减少。对于这类标本，建议用非EDTA抗凝剂进行重新计数，比如枸橼酸盐或在EDTA抗凝血中加入肝磷脂。 1.3.3 血液和抗凝剂的比例：1993年国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐用EDTA-K2，含量规定为1.5-2.2mg/ml[2]。血样质量在很大程度上取决于血液和抗凝剂的比例。采血量相对较少则抗凝剂比例过高，会造成血小板肿胀，崩解。如果血液量较多，则抗凝剂相对不足，超过了抗凝剂的抗凝能力，可能造成标本抗凝欠佳，出现凝块或肉眼看不见的微凝块，均可造成血小板假性减少。
1.3标本放置时间的影响：
1.3.1标本放置时间不足：在实际工作中，采取标本后立即进行检测，有时会出现血小板计数假性减少现象。这是由于血小板离体后，其形态立即发生变化，其外膜形成的微小管游离端向外伸展，从而在血小板周围形成丝状伪足，数个这样的血小板伪足相互纏绕，形成血小板可逆聚集体，其体积一般和淋巴细胞大小相似。由于这种血小板不被溶血剂溶解，故而使血小板计数暂时减少，随着时间的延长，抗凝剂能使血小板由盘状变为球状，血小板伪足回缩到胞质内，相互缠绕的血小板解散，使这种假性聚集发生一定程度的解聚。所以，为了提高准确性，建议在采血后放置15～20min再测定可得到准确结果[3]。
1.3.2标本放置时间过长：采血后放置时间过长，可产生巨大血小板，这种体积偏大的血小板被误认为小红细胞而不被纳入血小板计数范围，造成血小板计数下降，所以标本检测最好控制在5-30分钟，最长不能超过两小时[4]。
1.4计数血小板方法学缺陷造成的影响：
自动化的血液分析仪，无论是阻抗法还是光散射法，对于血小板数及形态正常的标本，结果一般比较可靠，但不能完全排除非血小板有形成分（如红、白细胞碎片或杂物）的干扰，有时所得结果误差甚大，甚至难以计数[5]。其原因是：这些方法基本上都是依据细胞的大小进行区分和计数的，而正常人的血小板体积相差甚大，可自2fl至20fl以上。当血小板体积小于2fl时，仪器会把它当作噪音不进行计数，从而使血小板计数结果偏低。当标本中存在大血小板时，其体积分布直方图不是对称的，而是明显地向右延伸，即血小板分布峰右移，MPV（平均血小板体积）明显增高，一般大于12 fl，而同时MCV和RDW（红细胞体积分布宽度）正常，排除小红细胞影响。MPV阈值为2～18 fl，当血小板体积大于25 fl时，这些大血小板很有可能被误认为小红细胞而不纳入血小板计数范围，使血小板计数结果偏低。
血小板计数对机采血小板的采集有重要的参考价值。由于血小板计数影响因素较多，常常造成血小板计数假性减少，在实际工作中，要排除一些干扰因素，正确操作，准确测定血小板数，保证血小板检测结果的准确性。为血小板的采集提供有力的支持，从而保证血液质量，保障临床用血。
参考文献：
[1]李永红，钟步云.血细胞分析仪测血小板结果偏低的原因及纠正方法[J].临床检验杂志，2001，19（2）：112.
[2]刘健.抗凝剂对血小板及其参数检测结果的影响分析[J].国际医药卫生导报，2004；10（8）：64-65.
[3]张玉莉。秦兴侠.末梢血标本放置时间对血小板测定结果的影响[J].医学理论与实践2010，14（6）：569
[4]齐天蕊.血小板计数误差与标本放置时间关系的探讨[J].医学文选，2003，22（4）：532.
[5]李兴武.全自动血细胞分析仪计数血小板影响因素分析及纠正[J].中国误诊学杂志，2002，2（3）：387-389.
关键词：血小板计数；血小板假性减少；血细胞分析仪
机采血小板捐献者采集前血小板计数的多少，对血小板的采集起决定性作用，出于对献血者保护的原则，血小板计数小于150×109/L的献血者不能捐献血小板。在实际工作中，有一部分可以达到捐献指标的献血者，由于操作原因使血小板计数假性减少，小于捐献指标，从而不能进行血小板的捐献，造成血液紧张，这是血站经常会遇到的问题，现就工作人员操作原因所致血小板假性减少进行简单的探讨。
对象与方法
1.一般资料
选取我站2012年9月到2013年3月机采血小板捐献者初筛血小板计数小于150×109/L 153例（均为EDTA-K2抗凝，其中采血不顺利者21例）。
2.方法
2.1主要仪器与试剂：
仪器：HORIBA ABX Pentra60血細胞分析仪、Olympus显微镜（仪器均于校准期内使用。）。
试剂：配套原装进口试剂（试剂均于有效期内使用）。
2.2实验：
2.2.1质量控制 本实验室参加卫生部临检中心室间质评，结果合格。实验前做室内质控，质控品为美德太平洋科技有限公司出品，结果在控。
2.2.2 对初筛血小板<150×109/L的153位血小板捐献者重新抽血，分别注入EDTA-K2抗凝管（A管）2ml和枸橼酸抗凝管（B管）2ml，充分混匀，按照第2版《全国临床检验操作规程》进行血小板血细胞分析仪计数（A、B管）；人工显微镜计数（B管），每个标本由2个人分别计数2次取平均值作为参考。10分钟内分别将初筛标本、复查标本A管和B管抗凝血涂血片经瑞氏染色显微镜观察。
2.2.3将EDTA-K2抗凝管（A管）室温放置，分别于采集后立即、采集后15～20min和采集后2h按照第2版《全国临床检验操作规程》进行血小板血细胞分析仪计数。
统计学方法：应用配对t检验进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义；应用q检验进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
应用配对t检验进行统计学处理，P<0.05，所有标本初筛结果与复查结果正常后和手工计数法结果相比差异有统计学意义（P<0.05）。
将153例血小板减少标本分为4组，即①抽血不当因素：第一次采集过程不顺利的21例PLT直方图出现无拟合曲线、翘尾等现象，镜下可见大量血小板凝块或小堆积，重新采集标本即复检A管和B管抗凝血涂片中均无成簇血小板，血小板散在分布，大小较为均一，标本无黄疽脂血等异常。②EDTA依赖性凝集组：两次采集过程均顺利，EDTA抗凝结果（初筛管、复检A管）均不正常，血片中有大量血小板聚集，一般为10个～20个血小板聚集成堆，更大的聚集有50个以上，而与之相对应的B管血涂片则无聚集血小板，血小板呈散在分布。③两次采集过程均顺利，镜检红细胞呈缗钱状排列，血小板成群或散在分布，数量正常，同时结合标本外观，试管内有许多沙粒样凝集颗粒，初检结果WBC、RBC、HB、HCT、MCV、MCHC、PLT等许多检测项目均异常，尤其是RBC数值很低，可考虑是冷凝集原因造成，标本经37℃水浴15 min后，上述现象消失，重新检测结果正常。④PLT直方图出现多峰、后峰翘起等，镜下血涂片中均无成簇血小板，血小板散在分布，血小板数量正常（每个油镜视野可见6～12个血小板），但是大血小板数量增多，体积接近小红细胞。
应用q检验进行统计学处理，采集后立即与采集后15～20min、手工法校正10min内对比组和采集后15～20min与手工法校正10min内对比组的P>0.05，表明对比组之间不具有显著性的差别；采集后2h标本与采集后立即、采集后15～20min、手工法校正10min内的对比组之间的P<0.05，表明对比组之间具有显著性的差别，因而认为标本放置超过20min后检测对检测结果有影响。
讨论
1.1标本采集过程的影响：静脉采血不顺利，抽血技术不熟练，难以做到一针见血，造成抽血时间延长，止血带使用时间超过3分钟，可引起血小板计数下降。因长时间捆扎止血带使静脉极度充盈、压力增高，可能会造成血管损伤或某些组织因子进入血液，也可能穿刺时相对肿胀的肢体内的组织因子进入注射器内，加快血液凝固。多次穿刺引起皮下出血，组织损伤，组织凝血因子混入血标本中产生肉眼看不见的小凝块，在这种情况下，血小板就出现假性减少，根据抽血不顺利的程度不同，也就造成血小板的数量出现假性减少的程度不一 [1]。
1.2标本质量的影响：
1.2.1.标本采集后处理：采血后立即颠倒混均8次，检测前混匀标本。若采血后混匀不及时、混匀不充分导致抗凝不充分而引起血小板聚集，血液凝固，严重影响血小板计数。
1.2.2抗凝剂EDTA的影响造成：按照国际血液学标准化委员会（ICSH）的建议，1.5～2.2mg的EDTA-K2抗凝1ml的全血可以抑制血小板聚集，从而达到抗凝的目的。但有极少数人的血小板在用EDTA抗凝时，反而会出现血小板聚集，这种EDTA依赖性假性血小板减少可能与血浆中存在的抗血小板抗体和/或抗心磷脂抗体等自身抗体有关，发生率约为0.2%，但无任何病理、生理意义，也与特殊药物使用无关。另一种现象是血小板粘附于白细胞上的“血小板卫星现象”，此现象与冷纤维蛋白原有关，或与血栓收缩蛋白有关，其机理是在EDTA的存在下，不仅包括来自血小板膜表面的GPⅡb/Ⅲa，而且包括IgG抗体直接与隐蔽抗原作用，其中包括来自血小板膜表面的GPⅡb/Ⅲa和来自成熟中性多核细胞的γ-Fc受体Ⅲ（CD16）的相互作用。发生率为1.2万分之一，与疾病和药物也无关。无论抗凝剂EDTA的影响，还是“血小板卫星现象”虽无任何病理、生理意义，但均可造成血小板假性减少。对于这类标本，建议用非EDTA抗凝剂进行重新计数，比如枸橼酸盐或在EDTA抗凝血中加入肝磷脂。 1.3.3 血液和抗凝剂的比例：1993年国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐用EDTA-K2，含量规定为1.5-2.2mg/ml[2]。血样质量在很大程度上取决于血液和抗凝剂的比例。采血量相对较少则抗凝剂比例过高，会造成血小板肿胀，崩解。如果血液量较多，则抗凝剂相对不足，超过了抗凝剂的抗凝能力，可能造成标本抗凝欠佳，出现凝块或肉眼看不见的微凝块，均可造成血小板假性减少。
1.3标本放置时间的影响：
1.3.1标本放置时间不足：在实际工作中，采取标本后立即进行检测，有时会出现血小板计数假性减少现象。这是由于血小板离体后，其形态立即发生变化，其外膜形成的微小管游离端向外伸展，从而在血小板周围形成丝状伪足，数个这样的血小板伪足相互纏绕，形成血小板可逆聚集体，其体积一般和淋巴细胞大小相似。由于这种血小板不被溶血剂溶解，故而使血小板计数暂时减少，随着时间的延长，抗凝剂能使血小板由盘状变为球状，血小板伪足回缩到胞质内，相互缠绕的血小板解散，使这种假性聚集发生一定程度的解聚。所以，为了提高准确性，建议在采血后放置15～20min再测定可得到准确结果[3]。
1.3.2标本放置时间过长：采血后放置时间过长，可产生巨大血小板，这种体积偏大的血小板被误认为小红细胞而不被纳入血小板计数范围，造成血小板计数下降，所以标本检测最好控制在5-30分钟，最长不能超过两小时[4]。
1.4计数血小板方法学缺陷造成的影响：
自动化的血液分析仪，无论是阻抗法还是光散射法，对于血小板数及形态正常的标本，结果一般比较可靠，但不能完全排除非血小板有形成分（如红、白细胞碎片或杂物）的干扰，有时所得结果误差甚大，甚至难以计数[5]。其原因是：这些方法基本上都是依据细胞的大小进行区分和计数的，而正常人的血小板体积相差甚大，可自2fl至20fl以上。当血小板体积小于2fl时，仪器会把它当作噪音不进行计数，从而使血小板计数结果偏低。当标本中存在大血小板时，其体积分布直方图不是对称的，而是明显地向右延伸，即血小板分布峰右移，MPV（平均血小板体积）明显增高，一般大于12 fl，而同时MCV和RDW（红细胞体积分布宽度）正常，排除小红细胞影响。MPV阈值为2～18 fl，当血小板体积大于25 fl时，这些大血小板很有可能被误认为小红细胞而不纳入血小板计数范围，使血小板计数结果偏低。
血小板计数对机采血小板的采集有重要的参考价值。由于血小板计数影响因素较多，常常造成血小板计数假性减少，在实际工作中，要排除一些干扰因素，正确操作，准确测定血小板数，保证血小板检测结果的准确性。为血小板的采集提供有力的支持，从而保证血液质量，保障临床用血。
参考文献：
[1]李永红，钟步云.血细胞分析仪测血小板结果偏低的原因及纠正方法[J].临床检验杂志，2001，19（2）：112.
[2]刘健.抗凝剂对血小板及其参数检测结果的影响分析[J].国际医药卫生导报，2004；10（8）：64-65.
[3]张玉莉。秦兴侠.末梢血标本放置时间对血小板测定结果的影响[J].医学理论与实践2010，14（6）：569
[4]齐天蕊.血小板计数误差与标本放置时间关系的探讨[J].医学文选，2003，22（4）：532.
[5]李兴武.全自动血细胞分析仪计数血小板影响因素分析及纠正[J].中国误诊学杂志，2002，2（3）：387-389.