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【摘要】目的：探讨罗格列酮对COPD肺高压大鼠气道炎症及血管重塑中的作用及其机制。方法：36只wistar大鼠随机分为肺高压组（A组）、治疗组(B组)和空白对照组（C组），前两组以烟熏、低氧和脂多糖（LPS）建立慢性支气管炎肺动脉高压病的大鼠模型，B组第3周起，同时给以盐酸罗格列酮治疗，C组给予生理盐水模拟造模和治疗。比较各组大鼠肺动脉压力和结构变化，并分析PPARγ与血管重建的相关性。结果 ：A组肺血管压力（mPAP和RVSP）和重塑程度(MA%和MT%)均高于D组显著增高(P均＜0.05)。经罗格列酮治疗后，B组上述指标均较A组明显下降(P均＜0.05)。A、B、C组肺组织的PPARγ mRNA水平依次升高（P<0.05）.。结论 ： PPARγ激动剂——罗格列酮通过下调PPARγ转录水平，发挥抑制慢性气道炎症和改善肺血管重塑的作用。
【关键词】肺高压；慢性支气管炎；重塑；血管；过氧化物酶增殖物激活受体γ
The effects of peroxisome proliferators-activated receptor γ (PPARγ) agonist on vascular remodeling in pulmonary hypertension with COPD
Wang ChenWang XinTang HuapingHan WeiCao Jilan
【Abstract】Objective To explore the effects of peroxisome proliferators-activated receptor γ (PPARγ) agonist on vascular remodeling in pulmonary hypertension with COPD. Methods36 wistarrats were divided into 3 groups：pulmonary hypertension group（Group A）,Rosiglitazone group(Group B) and controlled group(Group C). The mPAP and RVSP were detected after pulmonary artery catheterization, while MA% and MT% of the pulmonary vascular wall were measured in histological sections. PPARγ mRNA in lung tissue was assessed by RT-PCR. ResultsThe pressure (mPAP and RVSP）and remodeling (MA%和MT%) of pulmonary vessels in group A were aggravated than in group C (P＜0.05) and were extenuated with rosiglitazone (P＜0.05). PPARγ mRNA were increased in turn of group A, group B and group C. ConclusionRosiglitazone alleviates the pulmonary artery remodeling and pulmonary hypertension by up-regulating transcription of PPARγ.
【keyword】pulmonary hypertension； chronic bronchitis；remodeling； vascular; peroxisome proliferator- activated receptor γ
【中图分类号】R85【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)04-0036-02
肺血管重塑和血管收縮是COPD肺动脉高压形成和维持的关键环节[1]。过氧化物酶增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activted receptor γ, PPARγ）参与了COPD的气道炎症和重塑过程，但其在COPD肺高压中的作用研究尚少。本研究在COPD肺高压大鼠的动物模型上，观察 PPARγ在肺组织的表达及对血管重塑的作用。
1 材料和方法
1.1 材料:
1.1. 1 动物：雄性wistar大鼠36只，购自青岛市药检所，6-8周龄，体重220±20g，SPF级饲养。
1.1. 2 试剂：香烟(哈德门,青岛卷烟厂)；盐酸罗格列酮（文迪雅，4mg/片）；LPS（美国Sigma公司）；IL-8 ELISA测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Trizol试剂、M-MuLV一步法RT-PCR试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）；引物有上海生工生物工程有限公司合成。
1.1.3 设备：自制烟熏箱和低氧仓、智能氧浓度监测仪、核酸蛋白分析仪、分光光度计、Labnet PCT仪、单人净化工作台、水平电泳仪、低温离心机、凝胶成像分析系统等。
1.2方法
1.2.1动物分组和模型的建立：雄性wistar大鼠36只，随机分为3组：每组12只。A组（肺高压组）、B组（治疗组）和C组（空白对照组）。A组：参照钟小宁[2]等方法制作COPD肺高压大鼠模型: 将大鼠置于自制烟熏箱中，被动吸烟，烟熏约10分钟，休息5分钟后再重复烟熏，每天2h，持续6周，第1、14天气道滴入脂多糖(LPS)200ug，最后2周叠加低氧，氧浓度18%；B组：与A组相似，但是在最后2周加入罗格列酮，每支小鼠每天1mg；C组：正常饲养。
1.2.2 肺血流动力学测定:模型制备完成后第2天以1％戊巴比妥钠（30－50mg/kg）腹腔内注射麻醉后通过压力传感器测得平均肺动脉压（mPAP）。
1.2.3 组织学检查：肺组织10%中性甲醛固定后，常规脱水包埋，并作HE和维多利亚蓝-立春红（VP）染色。按文献方法[3]观测直径50μm~100μm的腺泡内肌化型小动脉的管壁厚度比(MT%)和管壁面积比(MA%)。MT%=[(动脉外径-管腔内径)/2]/动脉外径，MA%=(血管总面积-管腔面积)/血管总面积。
1.2.4 RT-PCR检测PPARγmRNA的转录水平：取1ul mRNA产物按照一步法逆转录试剂盒说明书合成cDNA，以此为模板行PCR扩增，序列为：PPARγ上游5’-TCTCTCCGTAATGGAAGACC-3’,下游：5’-GCATTATGAGACATCCCCAC-3’，249bp；βactin：5’-AGCCATGTAGCCATCC-3’，下游：5’-AGCCATGTAGCCATCC-3’,217bp。PPARγ mRNA的相对表达水平采用PPARγ：β-actin计算得出。
1.3 统计学处理:所有数据以x±s表示，数据运用SPSS11.5统计软件处理。单因素方差分析，组间比较用t检验，并做Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般表现:研究结束时，A组有2只大鼠分别在第5周和第6周发生死亡，尸解发现明显的肺气肿和肺心病；B组有1只大鼠在第5周因误吸死亡，C组无一死亡。A组死亡率高明显高于对照组（χ2=29.39，P<0.01）。
2.2 肺血流动力学和RV/LV+S分析:A组mPAP、RVSP和RV/LV+S均高于对照组（p<0.05），提示所建模型存在典型的肺动脉高压和肺心病表现；罗格列酮治疗后，B组的RVSP和mPAP和较A组明显下降（p<0.05），但RV/LV+S值虽有所下降，但未构成统计学差异（p>0.05），提示罗格列酮治疗能够改善肺动脉血流动力学，但对于心脏重建的影响有限（表1）。
2.3 肺血管重塑比较：对直径50~100μm肌化型动脉进行图像分析显示，A组MA%、MT%分别为66%和50%，较对照组（40%和24%）明显升高（P均<0.01）；B组MA%、MT%较A组明显下降，分别为48%和31%，但仍高于对照组（P均<0.05）。见表2，见附图1。
2.4 肺组织PPARγ的mRNA表达水平：A、B、C组肺组织内PPARγ的转录水平依次递增，差异有统计学意义（F=90.665, P＜0.01）。见图1、表3。
3 讨论
肺动脉高压和肺心病是COPD的重要晚期并发症之一，以往人们认为COPD合并肺高压与慢性缺氧有关。但研究发现在COPD早期存在血管重塑，成为日后肺动脉压力升高的基础。各种细胞生长因子、炎症因子和细胞同时参与了COPD合并肺高压的形成过程，慢性气道炎症和缺氧是此类肺高压血管重塑和肺动脉高压形成的共同基础。因此COPD继发的肺高压必然与其他单纯低氧诱导的肺高压存在的显著差异。在COPD早期的炎症损伤与修复过程中，激活的炎细胞释放各种炎症因子和细胞因子，促进肺小动脉血管平滑肌、成纤维细胞增殖分裂和细胞外基质在动脉内层沉积，共同参与动脉结构重建，而非仅在低氧后才发生[4]。但缺氧更有利于血管重建的形成，因此在模型后期叠加两周低氧干预以缩短制模时间[2]。
过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）在脂肪细胞的分布及其在能量代谢中的作用已被公认，PPARγ激动剂——罗格列酮，作为新型胰岛素增敏剂在临床已被广泛使用。近年来研究发现，PPARγ作为核转录因子在调控能量代谢以外，还参与多种疾病的炎症和重建过程，通过抑制血管增生和胶原沉积过程，在高血压、肿瘤等血管重建相关性疾病中发挥保护作用[5]。以往研究发现，在COPD的肺组织内PPARγ的表达减少，激活PPARγ能够减轻气道炎症和气道重建[6]。那么激活PPARγ是否改善COPD的肺血管重建？作者在COPD合并肺高压的大鼠模型上进行随机对照研究。结果显示，罗格列酮治疗，PPARγ的转录明显增强，大鼠支气管管壁炎症细胞浸润及血管管壁增厚较模型组明显减轻，肺动脉压力、肺血管管壁厚度和横截面积明显降低。PPARγ可通过多种途径参与血管重构的过程，减少平滑肌细胞对结缔组织生长因子（CTGF）的释放，抑制血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）和IV型胶原的表达等，需要进一步研究PPARγ在COPD中血管重构中的作用方式[7,8]。另外，治疗后RV/LV+S值未明显下降，可能与心脏重构晚于血管重构或者样本量限制等因素有关，因此不能排除罗格列酮对心脏重建的影响，还需要进一步研究。
综上所述，PPARγ参与了肺高压大鼠气道炎症及血管重塑的形成，罗格列酮通过激活PPARγ有效抑制气道及肺血管炎症、抑制血管外膜纤维组织的增生。本研究为PPARγ合成配体治疗肺高压提供了理论依据，为临床探索治疗肺高压的新型药物提供了新的思路。
参考文献
[1] Peinado VI, Pizarro S, Barberà JA.Pulmonary vascular involvement in COPD[J]. Chest, 2008, 134(4): 808-814
[2] 钟小宁,白晶，施焕中,等. 慢性支气管炎与肺气肿大鼠气道炎症与重塑的实验研究[J].中华结核和呼吸杂志，2003，26（12）:750-755
[3] 陈劲龙，冉王鑫.血管内皮生长因子与烟雾暴露所致大鼠肺气肿发病关系的研究[J].中华结核和呼吸杂志，2003，26(11):67-74
[4] Lu X, Murphy TC, Nanes MS, et al. PPARγ regulates hypoxia-induced Nox4 expression in human pulmonary artery smooth muscle cells through NF-κB[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2010, 299(4): L559-566
[5] Duan SZ, Usher MG, Mortensen RM. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-mediated effects in the vasculature［J］. Circ Res, 2008, 102(3): 283-294
[6] Spears M, McSharry C, Thomson NC. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists as potential anti-inflammatory agents in asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J]. Clin Exp Allergy, 2006, 36(12): 1494-1504
[7] Gao DF, Niu XL, Hao GH, et al. Rosiglitazone inhibits angiotensin II-induced CTGF expression in vascular smooth muscle cells––Role of PPAR-γ in vascular fibrosis[J]. Bioche Pharmaco 2007, 73(2): 185-197
[8] Aljada A, O'Connor L, Fu YY, et al. PPAR gamma ligands, rosiglitazone and pioglitazone, inhibit bFGF- and VEGF-mediated angiogenesis. Angiogenesis, 2008, 11(4):361-367
作者单位：266071 青岛大学医学院附属青岛市市立医院东院
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等內容请以PDF格式阅读原文
【关键词】肺高压；慢性支气管炎；重塑；血管；过氧化物酶增殖物激活受体γ
The effects of peroxisome proliferators-activated receptor γ (PPARγ) agonist on vascular remodeling in pulmonary hypertension with COPD
Wang ChenWang XinTang HuapingHan WeiCao Jilan
【Abstract】Objective To explore the effects of peroxisome proliferators-activated receptor γ (PPARγ) agonist on vascular remodeling in pulmonary hypertension with COPD. Methods36 wistarrats were divided into 3 groups：pulmonary hypertension group（Group A）,Rosiglitazone group(Group B) and controlled group(Group C). The mPAP and RVSP were detected after pulmonary artery catheterization, while MA% and MT% of the pulmonary vascular wall were measured in histological sections. PPARγ mRNA in lung tissue was assessed by RT-PCR. ResultsThe pressure (mPAP and RVSP）and remodeling (MA%和MT%) of pulmonary vessels in group A were aggravated than in group C (P＜0.05) and were extenuated with rosiglitazone (P＜0.05). PPARγ mRNA were increased in turn of group A, group B and group C. ConclusionRosiglitazone alleviates the pulmonary artery remodeling and pulmonary hypertension by up-regulating transcription of PPARγ.
【keyword】pulmonary hypertension； chronic bronchitis；remodeling； vascular; peroxisome proliferator- activated receptor γ
【中图分类号】R85【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)04-0036-02
肺血管重塑和血管收縮是COPD肺动脉高压形成和维持的关键环节[1]。过氧化物酶增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activted receptor γ, PPARγ）参与了COPD的气道炎症和重塑过程，但其在COPD肺高压中的作用研究尚少。本研究在COPD肺高压大鼠的动物模型上，观察 PPARγ在肺组织的表达及对血管重塑的作用。
1 材料和方法
1.1 材料:
1.1. 1 动物：雄性wistar大鼠36只，购自青岛市药检所，6-8周龄，体重220±20g，SPF级饲养。
1.1. 2 试剂：香烟(哈德门,青岛卷烟厂)；盐酸罗格列酮（文迪雅，4mg/片）；LPS（美国Sigma公司）；IL-8 ELISA测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Trizol试剂、M-MuLV一步法RT-PCR试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）；引物有上海生工生物工程有限公司合成。
1.1.3 设备：自制烟熏箱和低氧仓、智能氧浓度监测仪、核酸蛋白分析仪、分光光度计、Labnet PCT仪、单人净化工作台、水平电泳仪、低温离心机、凝胶成像分析系统等。
1.2方法
1.2.1动物分组和模型的建立：雄性wistar大鼠36只，随机分为3组：每组12只。A组（肺高压组）、B组（治疗组）和C组（空白对照组）。A组：参照钟小宁[2]等方法制作COPD肺高压大鼠模型: 将大鼠置于自制烟熏箱中，被动吸烟，烟熏约10分钟，休息5分钟后再重复烟熏，每天2h，持续6周，第1、14天气道滴入脂多糖(LPS)200ug，最后2周叠加低氧，氧浓度18%；B组：与A组相似，但是在最后2周加入罗格列酮，每支小鼠每天1mg；C组：正常饲养。
1.2.2 肺血流动力学测定:模型制备完成后第2天以1％戊巴比妥钠（30－50mg/kg）腹腔内注射麻醉后通过压力传感器测得平均肺动脉压（mPAP）。
1.2.3 组织学检查：肺组织10%中性甲醛固定后，常规脱水包埋，并作HE和维多利亚蓝-立春红（VP）染色。按文献方法[3]观测直径50μm~100μm的腺泡内肌化型小动脉的管壁厚度比(MT%)和管壁面积比(MA%)。MT%=[(动脉外径-管腔内径)/2]/动脉外径，MA%=(血管总面积-管腔面积)/血管总面积。
1.2.4 RT-PCR检测PPARγmRNA的转录水平：取1ul mRNA产物按照一步法逆转录试剂盒说明书合成cDNA，以此为模板行PCR扩增，序列为：PPARγ上游5’-TCTCTCCGTAATGGAAGACC-3’,下游：5’-GCATTATGAGACATCCCCAC-3’，249bp；βactin：5’-AGCCATGTAGCCATCC-3’，下游：5’-AGCCATGTAGCCATCC-3’,217bp。PPARγ mRNA的相对表达水平采用PPARγ：β-actin计算得出。
1.3 统计学处理:所有数据以x±s表示，数据运用SPSS11.5统计软件处理。单因素方差分析，组间比较用t检验，并做Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般表现:研究结束时，A组有2只大鼠分别在第5周和第6周发生死亡，尸解发现明显的肺气肿和肺心病；B组有1只大鼠在第5周因误吸死亡，C组无一死亡。A组死亡率高明显高于对照组（χ2=29.39，P<0.01）。
2.2 肺血流动力学和RV/LV+S分析:A组mPAP、RVSP和RV/LV+S均高于对照组（p<0.05），提示所建模型存在典型的肺动脉高压和肺心病表现；罗格列酮治疗后，B组的RVSP和mPAP和较A组明显下降（p<0.05），但RV/LV+S值虽有所下降，但未构成统计学差异（p>0.05），提示罗格列酮治疗能够改善肺动脉血流动力学，但对于心脏重建的影响有限（表1）。
2.3 肺血管重塑比较：对直径50~100μm肌化型动脉进行图像分析显示，A组MA%、MT%分别为66%和50%，较对照组（40%和24%）明显升高（P均<0.01）；B组MA%、MT%较A组明显下降，分别为48%和31%，但仍高于对照组（P均<0.05）。见表2，见附图1。
2.4 肺组织PPARγ的mRNA表达水平：A、B、C组肺组织内PPARγ的转录水平依次递增，差异有统计学意义（F=90.665, P＜0.01）。见图1、表3。
3 讨论
肺动脉高压和肺心病是COPD的重要晚期并发症之一，以往人们认为COPD合并肺高压与慢性缺氧有关。但研究发现在COPD早期存在血管重塑，成为日后肺动脉压力升高的基础。各种细胞生长因子、炎症因子和细胞同时参与了COPD合并肺高压的形成过程，慢性气道炎症和缺氧是此类肺高压血管重塑和肺动脉高压形成的共同基础。因此COPD继发的肺高压必然与其他单纯低氧诱导的肺高压存在的显著差异。在COPD早期的炎症损伤与修复过程中，激活的炎细胞释放各种炎症因子和细胞因子，促进肺小动脉血管平滑肌、成纤维细胞增殖分裂和细胞外基质在动脉内层沉积，共同参与动脉结构重建，而非仅在低氧后才发生[4]。但缺氧更有利于血管重建的形成，因此在模型后期叠加两周低氧干预以缩短制模时间[2]。
过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）在脂肪细胞的分布及其在能量代谢中的作用已被公认，PPARγ激动剂——罗格列酮，作为新型胰岛素增敏剂在临床已被广泛使用。近年来研究发现，PPARγ作为核转录因子在调控能量代谢以外，还参与多种疾病的炎症和重建过程，通过抑制血管增生和胶原沉积过程，在高血压、肿瘤等血管重建相关性疾病中发挥保护作用[5]。以往研究发现，在COPD的肺组织内PPARγ的表达减少，激活PPARγ能够减轻气道炎症和气道重建[6]。那么激活PPARγ是否改善COPD的肺血管重建？作者在COPD合并肺高压的大鼠模型上进行随机对照研究。结果显示，罗格列酮治疗，PPARγ的转录明显增强，大鼠支气管管壁炎症细胞浸润及血管管壁增厚较模型组明显减轻，肺动脉压力、肺血管管壁厚度和横截面积明显降低。PPARγ可通过多种途径参与血管重构的过程，减少平滑肌细胞对结缔组织生长因子（CTGF）的释放，抑制血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）和IV型胶原的表达等，需要进一步研究PPARγ在COPD中血管重构中的作用方式[7,8]。另外，治疗后RV/LV+S值未明显下降，可能与心脏重构晚于血管重构或者样本量限制等因素有关，因此不能排除罗格列酮对心脏重建的影响，还需要进一步研究。
综上所述，PPARγ参与了肺高压大鼠气道炎症及血管重塑的形成，罗格列酮通过激活PPARγ有效抑制气道及肺血管炎症、抑制血管外膜纤维组织的增生。本研究为PPARγ合成配体治疗肺高压提供了理论依据，为临床探索治疗肺高压的新型药物提供了新的思路。
参考文献
[1] Peinado VI, Pizarro S, Barberà JA.Pulmonary vascular involvement in COPD[J]. Chest, 2008, 134(4): 808-814
[2] 钟小宁,白晶，施焕中,等. 慢性支气管炎与肺气肿大鼠气道炎症与重塑的实验研究[J].中华结核和呼吸杂志，2003，26（12）:750-755
[3] 陈劲龙，冉王鑫.血管内皮生长因子与烟雾暴露所致大鼠肺气肿发病关系的研究[J].中华结核和呼吸杂志，2003，26(11):67-74
[4] Lu X, Murphy TC, Nanes MS, et al. PPARγ regulates hypoxia-induced Nox4 expression in human pulmonary artery smooth muscle cells through NF-κB[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2010, 299(4): L559-566
[5] Duan SZ, Usher MG, Mortensen RM. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-mediated effects in the vasculature［J］. Circ Res, 2008, 102(3): 283-294
[6] Spears M, McSharry C, Thomson NC. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists as potential anti-inflammatory agents in asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J]. Clin Exp Allergy, 2006, 36(12): 1494-1504
[7] Gao DF, Niu XL, Hao GH, et al. Rosiglitazone inhibits angiotensin II-induced CTGF expression in vascular smooth muscle cells––Role of PPAR-γ in vascular fibrosis[J]. Bioche Pharmaco 2007, 73(2): 185-197
[8] Aljada A, O'Connor L, Fu YY, et al. PPAR gamma ligands, rosiglitazone and pioglitazone, inhibit bFGF- and VEGF-mediated angiogenesis. Angiogenesis, 2008, 11(4):361-367
作者单位：266071 青岛大学医学院附属青岛市市立医院东院
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