论文部分内容阅读
【摘 要】目的：研究阿德福韦酯抗乙型肝炎病毒疗效与乙型肝炎病毒前C/C区变异的相关性。方法：应用阿德福韦酯治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎30例，治疗前检测其前C/C区无基因变异，治疗后12周，24周，48周分别检测前C/C区变异位点，分析阿德福韦酯抗乙型肝炎病毒疗效与乙型肝炎病毒前C/C区变异的相关性；结果：30例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，抗病毒前检测前C/C区无变异；阿德福韦酯抗病毒治疗生化学完全应答：12周5例，24周13例，48周26例；病毒学完全应答：12周3例，24周10例，48周19例；阿德福韦酯抗病毒治疗后乙肝病毒前C/C区变异：12周检出A1896变异3例，T1762/A1764变异1例，T1766/A1768变异4例；24周检测出A1896变异5例，T1762/A1764变异2例，A1899变异2例，T1766/A1768变异6例；48周检测出A1896变异8例，T1762/A1764变异1例，A1899变异1例，T1766/A1768变异9例，A1896、T1766/A1768联合变异6例。A1896，T1766/A1768变异率与阿德福韦酯抗病毒治疗病毒学完全应答率成负相关（P<0.05）。结论：阿德福韦酯抗乙型肝炎病毒治疗会诱发乙肝病毒前C/C区A1896，T1762/A1764，T1766/A1768，A1899变异；A1896，T1766/A1768变异率增加会降低阿德福韦酯抗病毒疗效。
【关键词】乙型肝炎病毒（HBVDNA）；前C/C区；变异位点；阿德福韦酯
【中图分类号】R51 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0055—02
乙型肝炎病毒感染是影响人类健康的全球性问题。乙型肝炎病毒慢性感染的自然過程包括从无症状携带者到慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。随着抗乙型肝炎病毒药物核苷（酸）类似物的诞生，乙型肝炎患者的病情得到可良好的控制。但随着此类药物的长期应用，乙型肝炎病毒变异、耐药的问题凸现出来。依托于分子生物学技术的进展，众多学者致力于乙型肝炎病毒变异与抗病毒疗效的研究。Carman等人[1]首次发现HBV 前C区1896位点的变异可导致HBeAg 阴性的乙肝病毒感染，随后国内外众多学者对前C/C 区变异位点与疾病的相关性进行了一系列研究[2，3]。本课题通过检测应用阿德福韦酯治疗的乙型肝炎患者前C/C区变异位点来探讨阿德福韦酯抗病毒疗效与前C/C区变异位点的相关性，从而揭示阿德福韦酯抗病毒治疗应答不佳的分子生物学基础。
1 资料与方法
1.1一般资料
2007年1月至2013年5月黑龙江省院感染内科收治HBeAg阳性慢性乙肝患者30例，男19例，女11例；年龄22-62岁；抗病毒治疗前乙肝病毒前C/C区无变异。诊断符合2006年中华医学会肝病学分会与中华医学会感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[4]，并排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒的混合与重叠感染，排除药物性肝病、酒精性肝病和肝癌。
1.2血清指标检测
生化学指标应用德国西门子ADVIA 2400全自动生化分析仪检测；HBV血清标志物采用ELISA试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司试剂）检测；采用德国Roche罗氏LightCycler? 480II PCR扩增仪，应用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定HBVDNA载量，检测灵敏度500IU/ml。
1.3前C/C区变异位点及基因型检测
应用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测乙肝病毒DNA，扩增产物送上海英俊测序公司，经克隆后应用Sanger法测序。
1.4统计学处理
应用SPSS 13.0软件进行数据统计学分析，对治疗后出现前C/C区的变异率采用X2检验进行分析。患者血清生化学指标值用 ±S表示，HBV-DNA采用常用对数后 ±S表示，均采用t检验进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
30例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者中男19例，女11例；平均年龄42±20岁；HBV基因型均为C型；HBeAg阳性慢性肝炎30例应用阿德福韦酯抗病毒前、抗病毒12周、24周、48周检测乙肝病毒前C/C区变异位点。（见表1）抗病毒前C/C区无变异；阿德福韦酯抗病毒12周检测出A1896变异3例，T1762/A1764变异 1例，T1766/A1768变异4例；24周检测出A1896变异5例，T1762/A1764变异2例，A1899变异2例；T1766/A1768变异6例；48周检测出A1896变异8例，T1762/A1764变异1例，A1899变异1例，T1766/A1768变异9例，A1896、T1766/A1768联合变异6例。其中1例患者于64周时出现病毒反弹，检测前C/C区位点T1762/A1764，T1766/A1768，A1896，A1899均出现变异。统计学分析A1896 、T1766/A1768单变异及二者的联合变异与阿德福韦酯抗病毒治疗患者的病毒学完全应答率呈显著性负相关（P<0.05）， A1896 、T1766/A1768变异降低了阿德福韦酯抗病毒的病毒学的完全应答率，导致病毒学部分应答。
30例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者应用阿德福韦酯抗病毒治疗生化学及病毒学应答情况。（见表2、3）抗病毒12周生化学完全应答率16.6%（5/30），病毒学完全应答率10%（3/30）；抗病毒24周生化学完全应答率43.3%（13/30），病毒学完全应答率33.3%（10/30）；抗病毒48周生化学完全应答率86.7%（26/30），病毒学完全应答率63.3%（19/30）；其中1例患者于64周时出现病毒学突破（HBVDNA 3.2×104），无生化学突破。 3 讨论
HBeAg作为HBVDNA活跃复制、高传染性的标志，目前众多学者从分子生物学角度给与研究，但还没有完全阐释HBeAg的功能 [5，6] 。目前认为HBVDNA前C/C区A1896，T1726和A1764位点变异会阻止和减少HBeAg的合成，从而导致HBeAg阴转，甚至出现血清学转换，但HBV病毒仍活跃复制，病情进展[7]。亦有报道A1762T 、G1764A 双突变和肝癌的发生有密切关系[8，9]，可见此位点变异与疾病进展相关。也有学者报道HBeAg阳性患者也可检出A1896位点变异，与重型肝炎的发生有密切的关系，但其机制尚未阐明 [10]。本课题重点研究前C/C区变异位点与阿德福韦酯抗病毒应答疗效相关性，从而探讨乙肝病毒前C/C区变异对阿德福韦酯抗病毒疗效的影响。
自从应用核苷（酸）类似物抗乙肝病毒以来，众多学者致力于研究乙肝病毒的基因变异与核苷（酸）类似物抗乙肝病毒疗效的关系。有学者提出在核苷（酸）类似物抗病毒选择压力下会导致乙肝病毒出现基因变异，尤其是P区的耐药位点变异导致抗病毒疗效下降甚至耐药发生；亦有学者提出乙肝病毒准种概念，核苷（酸）类似物抗病毒治疗中乙肝病毒野生株被抑制复制，耐药株占主要，出现临床耐药表现，抗病毒疗效不佳。但直至目前乙肝病毒基因位点变异与核苷（酸）类似物抗病毒疗效的相关性机制尚不明确，因此本课题研究了乙肝病毒前C/C区变异位点与阿德福韦酯抗病毒疗效的相关性，从而探讨乙肝病毒除了P区以外基因变异与核苷（酸）类似物抗病毒疗效的关系。
本课题研究表明，随着阿德福韦酯抗病毒时间推移，乙肝病毒前C/C区A1896 、T1766/A1768位点变异逐渐增加，与抗病毒治疗的病毒学完全应答率成负相关，但对生化学的应答率无显著影响。前C/C区出现A1896 、T1766/A1768双变异患者，阿德福韦酯抗病毒期间乙肝病毒持续阳性，阿德福韦酯抗病毒疗效差，而T1762/A1764，A1899变异与阿德福韦酯抗病毒应答无统计学相关性。因此，在应用阿德福韦酯抗乙肝病毒治疗治疗期间检测前C/C区A1896 、T1766/A1768位点变异可以作为预测阿德福韦酯抗病毒疗效的指标，指导临床调整抗病毒方案。另外，本课题研究中1例患者在抗病毒64周时出现病毒学突破，阿德福韦酯出现临床耐药，检测前C/C区T1762/A1764，T1766/A1768，A1896，A1899位点均出现变异，分析其变异位点的出现是否与阿德福韦酯耐药有关尚需进一步扩大样本研究。
总之，前C/C区一些核苷酸位点的变异与核苷（酸）类似物抗乙肝病毒治疗相关，尤其是A1896，T1766/A1768位点变异与阿德福韦酯抗病毒疗效直接相关，但其详细机制还需进一步研究。
参考文献：
[1] Carman WF，Jalyan MR，Hadziyannis S，et al.Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection[J].Lancet，1989，2（ 8663） ：588-590.
[2] Sato S，Suzuki S，Akahane Y，et al.Hepatitis B virus strains with mutations in the core promoter in patients with fulminant hepatitis[J].Ann Intern Med，1995，122（ 4） ：241-248.
[3] 中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南[J].实用肝脏病杂志，2006，9（1）：8-18.
[4] Kurosaki， M.， N. Enomoto， Y. Asahina， I. Sakuma， T. Ikeda， S. Tozuka， N. Izumi， F. Marumo， and C. Sato. 1996. Mutations in the core promoter region of hepatitis B virus in patients with chronic hepatitis B. J. Med. Virol. 49：115-123.
[5] Jammeh S， Tavner F， Watson R， Thomas HC， Karayiannis P. Effect of basal core promoter and pre-core mutations on hepatitis B virus replication. J Gen Virol. 2008；89（4）：901–909.
[6] Kuang SY， Jackson PE， Wang JB. Specific mutation s of hepat iti s B virus in plasma predict liver cancer development .Proc Nat l Acad Sci U S A， 2004， 101 （ 10） ： 3575-3580.
[7] 刘悦晖 丁静娟 张权. 慢性乙型肝炎病毒感染者病毒前C 区和基本核心启动子区变异检测及意义. 中华消化杂志，2005， Vol. 25（9）： 9526-5
[8] 王静艳，穆桂玲，刘沛，等.乙型重型肝炎基因变异与免疫异常的关系.[J].中华传染病杂志，2001，19（2）：73-76.
[9] 孙奎霞，李杰，庄辉.中国慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗的耐药现况[J].肝脏，2011，16（2）：147-149，166.
[10] 谢南，李金明，熊德琴，等.基因芯片法检测 HBV 多位点变异和基因分型的临床价值[J].热带医学杂志，2010，10（4）：437-438，453.
[11] Liu F，Chen L，Yu DM，et al. Evolutionary patterns of hepatitis B virus quasispecies under different selective pressures： correlation with antiviral efficacy.[J].Gut，2011，60（9）：1269-1277.
注：黑龍江省卫生厅课题 编号：2006-435
【关键词】乙型肝炎病毒（HBVDNA）；前C/C区；变异位点；阿德福韦酯
【中图分类号】R51 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0055—02
乙型肝炎病毒感染是影响人类健康的全球性问题。乙型肝炎病毒慢性感染的自然過程包括从无症状携带者到慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。随着抗乙型肝炎病毒药物核苷（酸）类似物的诞生，乙型肝炎患者的病情得到可良好的控制。但随着此类药物的长期应用，乙型肝炎病毒变异、耐药的问题凸现出来。依托于分子生物学技术的进展，众多学者致力于乙型肝炎病毒变异与抗病毒疗效的研究。Carman等人[1]首次发现HBV 前C区1896位点的变异可导致HBeAg 阴性的乙肝病毒感染，随后国内外众多学者对前C/C 区变异位点与疾病的相关性进行了一系列研究[2，3]。本课题通过检测应用阿德福韦酯治疗的乙型肝炎患者前C/C区变异位点来探讨阿德福韦酯抗病毒疗效与前C/C区变异位点的相关性，从而揭示阿德福韦酯抗病毒治疗应答不佳的分子生物学基础。
1 资料与方法
1.1一般资料
2007年1月至2013年5月黑龙江省院感染内科收治HBeAg阳性慢性乙肝患者30例，男19例，女11例；年龄22-62岁；抗病毒治疗前乙肝病毒前C/C区无变异。诊断符合2006年中华医学会肝病学分会与中华医学会感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[4]，并排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒的混合与重叠感染，排除药物性肝病、酒精性肝病和肝癌。
1.2血清指标检测
生化学指标应用德国西门子ADVIA 2400全自动生化分析仪检测；HBV血清标志物采用ELISA试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司试剂）检测；采用德国Roche罗氏LightCycler? 480II PCR扩增仪，应用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定HBVDNA载量，检测灵敏度500IU/ml。
1.3前C/C区变异位点及基因型检测
应用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测乙肝病毒DNA，扩增产物送上海英俊测序公司，经克隆后应用Sanger法测序。
1.4统计学处理
应用SPSS 13.0软件进行数据统计学分析，对治疗后出现前C/C区的变异率采用X2检验进行分析。患者血清生化学指标值用 ±S表示，HBV-DNA采用常用对数后 ±S表示，均采用t检验进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
30例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者中男19例，女11例；平均年龄42±20岁；HBV基因型均为C型；HBeAg阳性慢性肝炎30例应用阿德福韦酯抗病毒前、抗病毒12周、24周、48周检测乙肝病毒前C/C区变异位点。（见表1）抗病毒前C/C区无变异；阿德福韦酯抗病毒12周检测出A1896变异3例，T1762/A1764变异 1例，T1766/A1768变异4例；24周检测出A1896变异5例，T1762/A1764变异2例，A1899变异2例；T1766/A1768变异6例；48周检测出A1896变异8例，T1762/A1764变异1例，A1899变异1例，T1766/A1768变异9例，A1896、T1766/A1768联合变异6例。其中1例患者于64周时出现病毒反弹，检测前C/C区位点T1762/A1764，T1766/A1768，A1896，A1899均出现变异。统计学分析A1896 、T1766/A1768单变异及二者的联合变异与阿德福韦酯抗病毒治疗患者的病毒学完全应答率呈显著性负相关（P<0.05）， A1896 、T1766/A1768变异降低了阿德福韦酯抗病毒的病毒学的完全应答率，导致病毒学部分应答。
30例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者应用阿德福韦酯抗病毒治疗生化学及病毒学应答情况。（见表2、3）抗病毒12周生化学完全应答率16.6%（5/30），病毒学完全应答率10%（3/30）；抗病毒24周生化学完全应答率43.3%（13/30），病毒学完全应答率33.3%（10/30）；抗病毒48周生化学完全应答率86.7%（26/30），病毒学完全应答率63.3%（19/30）；其中1例患者于64周时出现病毒学突破（HBVDNA 3.2×104），无生化学突破。 3 讨论
HBeAg作为HBVDNA活跃复制、高传染性的标志，目前众多学者从分子生物学角度给与研究，但还没有完全阐释HBeAg的功能 [5，6] 。目前认为HBVDNA前C/C区A1896，T1726和A1764位点变异会阻止和减少HBeAg的合成，从而导致HBeAg阴转，甚至出现血清学转换，但HBV病毒仍活跃复制，病情进展[7]。亦有报道A1762T 、G1764A 双突变和肝癌的发生有密切关系[8，9]，可见此位点变异与疾病进展相关。也有学者报道HBeAg阳性患者也可检出A1896位点变异，与重型肝炎的发生有密切的关系，但其机制尚未阐明 [10]。本课题重点研究前C/C区变异位点与阿德福韦酯抗病毒应答疗效相关性，从而探讨乙肝病毒前C/C区变异对阿德福韦酯抗病毒疗效的影响。
自从应用核苷（酸）类似物抗乙肝病毒以来，众多学者致力于研究乙肝病毒的基因变异与核苷（酸）类似物抗乙肝病毒疗效的关系。有学者提出在核苷（酸）类似物抗病毒选择压力下会导致乙肝病毒出现基因变异，尤其是P区的耐药位点变异导致抗病毒疗效下降甚至耐药发生；亦有学者提出乙肝病毒准种概念，核苷（酸）类似物抗病毒治疗中乙肝病毒野生株被抑制复制，耐药株占主要，出现临床耐药表现，抗病毒疗效不佳。但直至目前乙肝病毒基因位点变异与核苷（酸）类似物抗病毒疗效的相关性机制尚不明确，因此本课题研究了乙肝病毒前C/C区变异位点与阿德福韦酯抗病毒疗效的相关性，从而探讨乙肝病毒除了P区以外基因变异与核苷（酸）类似物抗病毒疗效的关系。
本课题研究表明，随着阿德福韦酯抗病毒时间推移，乙肝病毒前C/C区A1896 、T1766/A1768位点变异逐渐增加，与抗病毒治疗的病毒学完全应答率成负相关，但对生化学的应答率无显著影响。前C/C区出现A1896 、T1766/A1768双变异患者，阿德福韦酯抗病毒期间乙肝病毒持续阳性，阿德福韦酯抗病毒疗效差，而T1762/A1764，A1899变异与阿德福韦酯抗病毒应答无统计学相关性。因此，在应用阿德福韦酯抗乙肝病毒治疗治疗期间检测前C/C区A1896 、T1766/A1768位点变异可以作为预测阿德福韦酯抗病毒疗效的指标，指导临床调整抗病毒方案。另外，本课题研究中1例患者在抗病毒64周时出现病毒学突破，阿德福韦酯出现临床耐药，检测前C/C区T1762/A1764，T1766/A1768，A1896，A1899位点均出现变异，分析其变异位点的出现是否与阿德福韦酯耐药有关尚需进一步扩大样本研究。
总之，前C/C区一些核苷酸位点的变异与核苷（酸）类似物抗乙肝病毒治疗相关，尤其是A1896，T1766/A1768位点变异与阿德福韦酯抗病毒疗效直接相关，但其详细机制还需进一步研究。
参考文献：
[1] Carman WF，Jalyan MR，Hadziyannis S，et al.Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection[J].Lancet，1989，2（ 8663） ：588-590.
[2] Sato S，Suzuki S，Akahane Y，et al.Hepatitis B virus strains with mutations in the core promoter in patients with fulminant hepatitis[J].Ann Intern Med，1995，122（ 4） ：241-248.
[3] 中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南[J].实用肝脏病杂志，2006，9（1）：8-18.
[4] Kurosaki， M.， N. Enomoto， Y. Asahina， I. Sakuma， T. Ikeda， S. Tozuka， N. Izumi， F. Marumo， and C. Sato. 1996. Mutations in the core promoter region of hepatitis B virus in patients with chronic hepatitis B. J. Med. Virol. 49：115-123.
[5] Jammeh S， Tavner F， Watson R， Thomas HC， Karayiannis P. Effect of basal core promoter and pre-core mutations on hepatitis B virus replication. J Gen Virol. 2008；89（4）：901–909.
[6] Kuang SY， Jackson PE， Wang JB. Specific mutation s of hepat iti s B virus in plasma predict liver cancer development .Proc Nat l Acad Sci U S A， 2004， 101 （ 10） ： 3575-3580.
[7] 刘悦晖 丁静娟 张权. 慢性乙型肝炎病毒感染者病毒前C 区和基本核心启动子区变异检测及意义. 中华消化杂志，2005， Vol. 25（9）： 9526-5
[8] 王静艳，穆桂玲，刘沛，等.乙型重型肝炎基因变异与免疫异常的关系.[J].中华传染病杂志，2001，19（2）：73-76.
[9] 孙奎霞，李杰，庄辉.中国慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗的耐药现况[J].肝脏，2011，16（2）：147-149，166.
[10] 谢南，李金明，熊德琴，等.基因芯片法检测 HBV 多位点变异和基因分型的临床价值[J].热带医学杂志，2010，10（4）：437-438，453.
[11] Liu F，Chen L，Yu DM，et al. Evolutionary patterns of hepatitis B virus quasispecies under different selective pressures： correlation with antiviral efficacy.[J].Gut，2011，60（9）：1269-1277.
注：黑龍江省卫生厅课题 编号：2006-435