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摘 要 选取正常荔枝叶片和受荔枝瘤瘿螨为害的荔枝叶片为样品，分别以索氏提取法和超声波提取法进行萃取，经气相色谱-质谱法（GC-MS）对不同叶片中的脂溶性成分进行分析和鉴定。结果表明，荔枝瘤瘿螨的为害会引起宿主叶片化学成分以及含量的变化，主要表现为抗逆相关成分如γ-谷甾醇等植物甾醇类物质含量的增多，以及与光合作用相关的成分如植物醇等化合物含量的减少。
关键词 荔枝瘤瘿螨；索氏提取法；超声波提取法；GC-MS
中图分类号 S667.1 文献标识码 A
Abstract The secondary metabolites of litchi leaves during the growth of normal and Aceria litchii（Keifer）invasion were extracted by Soxhlet and Ultrasonic methods. Then， the constituents were separated and indentified with GC-MS. The results showed the chemical composition and content of litchi leaves changed after Aceria litchii（Keifer）invasion， mainly reflected in the elevated levels of phytosterol， such as γ-clionasterol， and the reduced levels of phytol， which was involved in plant defense and photosynthesis respectively.
Key words Aceria litchii（Keifer）； Soxhlet extraction； Ultrasonic extraction； GC-MS
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.033
荔枝瘤瘿螨[Aceria litchii（Keifer）]又名荔枝毛瘿螨或毛蜘蛛，是危害荔枝和龙眼的主要害螨，主要分布于我国南方荔枝龙眼产区以及泰国、印度、美国佛罗里达州及夏威夷、澳大利亚、巴基斯坦等国家和地区[1-2]。荔枝瘤瘿螨主要危害寄主叶片，也可为害嫩梢和花果。叶片受害后叶面凸起，并从另一面凹陷处长出白色绒毛，绒毛渐变成黄褐色到红褐色，而且浓密，故称毛毡病[3]。受害严重的叶片完全失去其功能，最后干枯凋落。
虫瘿是由昆虫等致瘿生物诱导寄主植物细胞分裂加速而产生的一种异常组织[4-7]。虫瘿组织为致瘿昆虫提供了生长发育所需的基本食物源[8-9]，也为昆虫提供了抵御不良外界自然环境的栖身之地[10]。同时保护致瘿昆虫不受天敌的捕食[11]。虫瘿形成过程中，致瘿昆虫会造成周围部分寄主细胞和组织的异常生长，进而阻碍寄主植物的正常生长，并影响其生理活动，如光合作用等。同时，寄主植物体内次生代谢产物也发生相应变化，以应对其危害，如酚类物质、黄酮类物质含量的增加以及苯丙氨酸解氨酶活性（PAL）的提高等[12-15]。同样，荔枝瘤瘿螨入侵后的寄主叶片上会形成虫瘿，其形成必然会影响荔枝叶片细胞的生理生化代谢。但迄今为止，相关的研究还未见报道。因此，本试验选取正常荔枝叶片和受荔枝瘤瘿螨为害的荔枝叶片为材料，分别采取索氏提取法和超声波提取法提取样品，并通过气相色谱-质谱（GC-MS）对不同叶片中的脂溶性成分进行分析与鉴定，进而对2种材料的相关成分进行初步对比，为荔枝瘤瘿螨致畸机理和寄主植物抗病机制的研究提供线索，同时为后续相关实验提取方法的选择提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 荔枝瘤瘿螨采集自海南省儋州市宝岛新村荔枝园。荔枝树苗（品种：妃子笑）购自海南大学园艺园林学院实验苗圃，先盆栽种植于琼台师院温室大棚2个月，待生长稳定后选取20株生长一致的树苗进行荔枝瘤瘿螨接种，同时取20株作为对照，待55 d荔枝瘤瘿螨为害数量最多时分别采集接种叶片和对照组叶片作为试验材料。试验材料用蒸馏水洗净后放 置阴处，待晾干后装袋并置于-80 ℃冰箱保存。
1.1.2 仪器和试剂 试验所用主要仪器有HP6890/5975C型气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；KQ-500DB型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；RE-52系列旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；索氏提取器（上海仙象仪器仪表有限公司）。
试剂有乙醇（分析纯，上海化学试剂总厂）、氯仿（重蒸工业级，上海化学试剂总厂）、正己烷（分析纯，上海化学试剂总厂）。
1.2 方法
1.2.1 索氏提取法 将样品剪碎放入折叠好的滤纸纸筒内，称重封口，封口捏出凹面，在圆底烧瓶内加入300 mL的乙醇，放入玻璃球防止爆沸，安装索氏提取器，加热保持有液体不断回流至样品管内即可，虹吸5次，回收提取液，蒸干浓缩至无醇味，加入150 mL纯水溶解蒸干的提取物，倒入锥形瓶内，加入150 mL氯仿，进行混合，静置15 min，吸出下层溶液，上层溶液再次加入150 mL氯仿进行萃取，共进行3次。将氯仿层和水层分别进行蒸干浓缩，准备质谱分析。
1.2.2 超声波提取法 取样品50.0 g剪碎；用正己烷浸提3次，每次超声波处理30 min；过滤并合并3次正己烷提取液，对提取液进行蒸干浓缩，准备质谱分析。
2 结果与分析
经过GC-MS检测分析得总离子流图（图1～4）及各化学成分相对含量（表1）。
2.1 索氏提取法和超声波提取法对提取荔枝叶片化合物总量的比较 采用两种不同的方法，从荔枝受害叶片与正常叶片中共分离鉴定出47种化合物（表1）。其中索氏提取法中对照组提取了20种化合物，处理组提取了21种化合物；超声波提取法中对照组提取了35种化合物，处理组提取了23种化合物。在索氏提取法中，鉴定出的化合物含量占提取物总量（1 mg）的百分比，分别为对照组72.653%，处理组59.098%。超声波提取法中，鉴定出的化合物含量占提取物总量（1 mg）的百分比，分别是对照为54.581%，处理为43.386%。
2.2 索氏提取法和超声波提取法对提取荔枝叶片化合物含量和数量的比较
从分析结果（表1）可以看出，两种方法提取的成分差异较大，对照组与处理组间也存在较大差异，部分物质含量也发生了变化。两种方法得到的提取物主要由烃类、醇类、酚类、酸类构成。其中索氏提取中对照组特有的成分有4-[（1E）-3-羟基-1-丙烯基]-2-甲氧基苯酚、角鲨烯、β-生育酚、环鸦片甾烯醇，处理组特有的成分有α-蛇麻烯、杜松脑、亚油酸、硬脂酸、胆甾二烯、β-香树脂醇乙酸酯。超声波提取中对照组特有的成分有双环榄香烯、朱栾倍半萜、表双环倍半水芹烯、香树烯、刺伯烯、δ-杜松烯、大根香叶烯B、石竹烯氧化物、异匙叶桉油烯醇、橄榄酸酰胺、三十二烷，处理组特有的成分仅有1-二十六醛。4种样品中均存在的共性物质有4，6-二甲基-十二烷、异金合欢醇、新植二烯、二十一烷、植物醇、维生素E、β-豆甾醇、γ-谷甾醇。两种提取方法中4，6-二甲基-十二烷、异金合欢醇、二十一烷、γ-谷甾醇等化合物含量处理组均高于对照组，而植物醇则表现为处理组比对照组相对含量降低。
3 讨论与结论
本实验分别采用索氏提取法和超声波提取法对两种样品的脂溶性成分进行了提取比较，从两种方法鉴定出的化合物含量占提取物总量的百分比均表现为对照组高于处理组。推断其可能与荔枝瘤瘿螨的为害导致荔枝叶片细胞增生或非正常生长，从而引起叶片成分与含水量发生了变化有关。其次，荔枝瘤瘿螨的为害会造成荔枝叶片的局部枯萎，这也可能是对照组高于处理组的一个原因。
综合两种提取方法，本试验获得了4种生育酚，分别为δ-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚以及维生素E。与对照相比，这4种生育酚的含量除维生素E外，均在侵染后的荔枝叶片中有不同程度的降低。生育酚在自然界是由高等植物的绿叶经过光合作用合成，生育酚含量的降低，从侧面反映出，植物光合作用能力的降低[16]。进一步比较发现，对照组相比处理组植物醇含量明显降低，索氏提取中异植物醇的含量也明显下降。异植物醇和植物醇均为植物叶绿素组成成分。由此推断，荔枝瘤瘿螨的为害可能影响了寄主植物叶片叶绿素的合成。
倍半萜类物质是一类极为重要的植物次生代谢物质。植食性昆虫主要依靠嗅觉感受器辨别寄主植物的特异性气味进而趋向寄主植物。特异性气味的存在减少了昆虫在觅食过程中的盲目性[17]。在超声波提取法中，朱栾倍半萜这种倍半萜类物质的含量出现了对照组高于处理组的现象。朱栾倍半萜常用于昆虫引诱剂的筛选实验中。本研究中对照组含量高于处理组的原因可能与害螨逃避天敌昆虫的一种策略或者与干扰潜在竞争者有关。
所有试验材料的化合物中均含有β-豆甾醇、γ-谷甾醇等植物甾醇类物质，两种提取法中γ-谷甾醇的含量处理组相对于对照组均明显升高。有研究表明[18]在植物细胞膜内的植物甾醇与磷脂相互作用能够保持膜结构的稳定和调节细胞膜透性。植物甾醇参与植物对外界的胁迫反应，植物甾醇在植物抵抗许多不利因素（生物的和非生物的）的过程中发挥着重要作用[19]。同时，由表1可看出，二十一烷、二十九烷、三十烷等烷烃类物质均有所上升，烷烃类物质是植物表面蜡质层的组成部分，蜡质层是植物防御体系的重要组成部分，在防止病原物侵染、草食性昆虫及抵御环境胁迫如干旱、紫外线破坏和霜冻中发挥重要作用[20]。荔枝叶片在受到荔枝瘤瘿螨为害后，叶片内甾醇类物质以及烷烃类物质含量的升高是否参与了寄主抵御害虫为害的防御机制还需要进一步的试验验证。
参考文献
[1] 匡海源. 农螨学[M]. 北京： 农业出版社， 1986： 5-7.
[2] 匡海源. 中国经济昆虫志（第44册）， 蜱螨亚纲·瘿螨总科（一）[M]. 北京： 科学出版社， 1995： 57.
[3] 胡适连， 李剑书. 荔枝瘿螨的初步观察[J]. 荔枝科技通讯， 1987（1）： 14-17.
[4] 杨集昆. 森林与人类[M].北京： 中国林业出版社， 1985： 22-23.
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[7] 马双敏， 虞 泓， 李晨程， 等. 植物虫瘿[J]. 昆虫知识， 2008， 45（2）： 330-335.
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[9] Morris D C， Schwarz M P， Cooper S J. Phylogenetics of Australian acacia thrips： the evolution of behaviour and ecology[J]. Mol Phylogenet Evol， 2002， 25 （2）： 278-292. [10] Kurosu U.Host alternation of two tropical gall-forming aphids， Astegopteryx styracophila and A. pallida（Homoptera）[M]. Universidad de León， 1998： 227-234.
[11] Hawkins B A. Predators， parasitoids and pathogens asmortality agents in phatophagous insect populations[J]. Ecology， 1997， 78（7）： 2 145-2 152.
[12] Westphal E， Bronner R. Changes in leaves of susceptible and resistant Solanum dulcamara infested by the gall mite Eriophyes cladophthirus（Acarina， Eriphyoidea）[J]. Can J Botany， 1981， 59： 875-882.
[13] Schultz B B. Insect herbivores as potential causes of mortality and adaptation in gall forming insects[J]. Oecologia， 1992， 90（2）： 297-299.
[14]杨 勇， 陈顺立， 吴 晖， 等. 栗瘿蜂危害下锥栗叶片中黄酮含量的变化[J]. 福建林学院学报， 2005， 25（2）： 125-127.
[15]吴 晖， 陈顺立， 黄红青， 等. 锥栗抗栗瘿蜂性与苯丙氨酸解氨酶活性的关系[J]. 福建林学院学报， 2005， 25（4）： 304-307.
[16] 左大昆译. 维生素化学[M]. 北京： 中国轻工业出版社， 1959.
[17] 鲁玉杰， 张孝義. 信息化合物对昆虫行为的影响[J]. 昆虫知识， 2001， 38（4）： 262-266.
[18] Mireille Venken， Han Asard， Jan M C Geuns， et al. Senescence of oat leaves： changes in the free sterol composition and enzyme activities of the plasma membrane[J]. Plant Science， 1991， 79（1）： 3-11.
[19] 张喜春， 韩振海， ХоджайоваЛТ， 等. 植物体内甾醇的合成和生理作用[J]. 植物生理学通讯， 2001， 37（5）： 452-457
[20] 杨爱梅， 吴古飞， 杜 静， 等.枸杞表皮蜡质层成分及显微结构的研究[J]. 食品工业科技， 2011， 12（32）： 112-114.
关键词 荔枝瘤瘿螨；索氏提取法；超声波提取法；GC-MS
中图分类号 S667.1 文献标识码 A
Abstract The secondary metabolites of litchi leaves during the growth of normal and Aceria litchii（Keifer）invasion were extracted by Soxhlet and Ultrasonic methods. Then， the constituents were separated and indentified with GC-MS. The results showed the chemical composition and content of litchi leaves changed after Aceria litchii（Keifer）invasion， mainly reflected in the elevated levels of phytosterol， such as γ-clionasterol， and the reduced levels of phytol， which was involved in plant defense and photosynthesis respectively.
Key words Aceria litchii（Keifer）； Soxhlet extraction； Ultrasonic extraction； GC-MS
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.033
荔枝瘤瘿螨[Aceria litchii（Keifer）]又名荔枝毛瘿螨或毛蜘蛛，是危害荔枝和龙眼的主要害螨，主要分布于我国南方荔枝龙眼产区以及泰国、印度、美国佛罗里达州及夏威夷、澳大利亚、巴基斯坦等国家和地区[1-2]。荔枝瘤瘿螨主要危害寄主叶片，也可为害嫩梢和花果。叶片受害后叶面凸起，并从另一面凹陷处长出白色绒毛，绒毛渐变成黄褐色到红褐色，而且浓密，故称毛毡病[3]。受害严重的叶片完全失去其功能，最后干枯凋落。
虫瘿是由昆虫等致瘿生物诱导寄主植物细胞分裂加速而产生的一种异常组织[4-7]。虫瘿组织为致瘿昆虫提供了生长发育所需的基本食物源[8-9]，也为昆虫提供了抵御不良外界自然环境的栖身之地[10]。同时保护致瘿昆虫不受天敌的捕食[11]。虫瘿形成过程中，致瘿昆虫会造成周围部分寄主细胞和组织的异常生长，进而阻碍寄主植物的正常生长，并影响其生理活动，如光合作用等。同时，寄主植物体内次生代谢产物也发生相应变化，以应对其危害，如酚类物质、黄酮类物质含量的增加以及苯丙氨酸解氨酶活性（PAL）的提高等[12-15]。同样，荔枝瘤瘿螨入侵后的寄主叶片上会形成虫瘿，其形成必然会影响荔枝叶片细胞的生理生化代谢。但迄今为止，相关的研究还未见报道。因此，本试验选取正常荔枝叶片和受荔枝瘤瘿螨为害的荔枝叶片为材料，分别采取索氏提取法和超声波提取法提取样品，并通过气相色谱-质谱（GC-MS）对不同叶片中的脂溶性成分进行分析与鉴定，进而对2种材料的相关成分进行初步对比，为荔枝瘤瘿螨致畸机理和寄主植物抗病机制的研究提供线索，同时为后续相关实验提取方法的选择提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 荔枝瘤瘿螨采集自海南省儋州市宝岛新村荔枝园。荔枝树苗（品种：妃子笑）购自海南大学园艺园林学院实验苗圃，先盆栽种植于琼台师院温室大棚2个月，待生长稳定后选取20株生长一致的树苗进行荔枝瘤瘿螨接种，同时取20株作为对照，待55 d荔枝瘤瘿螨为害数量最多时分别采集接种叶片和对照组叶片作为试验材料。试验材料用蒸馏水洗净后放 置阴处，待晾干后装袋并置于-80 ℃冰箱保存。
1.1.2 仪器和试剂 试验所用主要仪器有HP6890/5975C型气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；KQ-500DB型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；RE-52系列旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；索氏提取器（上海仙象仪器仪表有限公司）。
试剂有乙醇（分析纯，上海化学试剂总厂）、氯仿（重蒸工业级，上海化学试剂总厂）、正己烷（分析纯，上海化学试剂总厂）。
1.2 方法
1.2.1 索氏提取法 将样品剪碎放入折叠好的滤纸纸筒内，称重封口，封口捏出凹面，在圆底烧瓶内加入300 mL的乙醇，放入玻璃球防止爆沸，安装索氏提取器，加热保持有液体不断回流至样品管内即可，虹吸5次，回收提取液，蒸干浓缩至无醇味，加入150 mL纯水溶解蒸干的提取物，倒入锥形瓶内，加入150 mL氯仿，进行混合，静置15 min，吸出下层溶液，上层溶液再次加入150 mL氯仿进行萃取，共进行3次。将氯仿层和水层分别进行蒸干浓缩，准备质谱分析。
1.2.2 超声波提取法 取样品50.0 g剪碎；用正己烷浸提3次，每次超声波处理30 min；过滤并合并3次正己烷提取液，对提取液进行蒸干浓缩，准备质谱分析。
2 结果与分析
经过GC-MS检测分析得总离子流图（图1～4）及各化学成分相对含量（表1）。
2.1 索氏提取法和超声波提取法对提取荔枝叶片化合物总量的比较 采用两种不同的方法，从荔枝受害叶片与正常叶片中共分离鉴定出47种化合物（表1）。其中索氏提取法中对照组提取了20种化合物，处理组提取了21种化合物；超声波提取法中对照组提取了35种化合物，处理组提取了23种化合物。在索氏提取法中，鉴定出的化合物含量占提取物总量（1 mg）的百分比，分别为对照组72.653%，处理组59.098%。超声波提取法中，鉴定出的化合物含量占提取物总量（1 mg）的百分比，分别是对照为54.581%，处理为43.386%。
2.2 索氏提取法和超声波提取法对提取荔枝叶片化合物含量和数量的比较
从分析结果（表1）可以看出，两种方法提取的成分差异较大，对照组与处理组间也存在较大差异，部分物质含量也发生了变化。两种方法得到的提取物主要由烃类、醇类、酚类、酸类构成。其中索氏提取中对照组特有的成分有4-[（1E）-3-羟基-1-丙烯基]-2-甲氧基苯酚、角鲨烯、β-生育酚、环鸦片甾烯醇，处理组特有的成分有α-蛇麻烯、杜松脑、亚油酸、硬脂酸、胆甾二烯、β-香树脂醇乙酸酯。超声波提取中对照组特有的成分有双环榄香烯、朱栾倍半萜、表双环倍半水芹烯、香树烯、刺伯烯、δ-杜松烯、大根香叶烯B、石竹烯氧化物、异匙叶桉油烯醇、橄榄酸酰胺、三十二烷，处理组特有的成分仅有1-二十六醛。4种样品中均存在的共性物质有4，6-二甲基-十二烷、异金合欢醇、新植二烯、二十一烷、植物醇、维生素E、β-豆甾醇、γ-谷甾醇。两种提取方法中4，6-二甲基-十二烷、异金合欢醇、二十一烷、γ-谷甾醇等化合物含量处理组均高于对照组，而植物醇则表现为处理组比对照组相对含量降低。
3 讨论与结论
本实验分别采用索氏提取法和超声波提取法对两种样品的脂溶性成分进行了提取比较，从两种方法鉴定出的化合物含量占提取物总量的百分比均表现为对照组高于处理组。推断其可能与荔枝瘤瘿螨的为害导致荔枝叶片细胞增生或非正常生长，从而引起叶片成分与含水量发生了变化有关。其次，荔枝瘤瘿螨的为害会造成荔枝叶片的局部枯萎，这也可能是对照组高于处理组的一个原因。
综合两种提取方法，本试验获得了4种生育酚，分别为δ-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚以及维生素E。与对照相比，这4种生育酚的含量除维生素E外，均在侵染后的荔枝叶片中有不同程度的降低。生育酚在自然界是由高等植物的绿叶经过光合作用合成，生育酚含量的降低，从侧面反映出，植物光合作用能力的降低[16]。进一步比较发现，对照组相比处理组植物醇含量明显降低，索氏提取中异植物醇的含量也明显下降。异植物醇和植物醇均为植物叶绿素组成成分。由此推断，荔枝瘤瘿螨的为害可能影响了寄主植物叶片叶绿素的合成。
倍半萜类物质是一类极为重要的植物次生代谢物质。植食性昆虫主要依靠嗅觉感受器辨别寄主植物的特异性气味进而趋向寄主植物。特异性气味的存在减少了昆虫在觅食过程中的盲目性[17]。在超声波提取法中，朱栾倍半萜这种倍半萜类物质的含量出现了对照组高于处理组的现象。朱栾倍半萜常用于昆虫引诱剂的筛选实验中。本研究中对照组含量高于处理组的原因可能与害螨逃避天敌昆虫的一种策略或者与干扰潜在竞争者有关。
所有试验材料的化合物中均含有β-豆甾醇、γ-谷甾醇等植物甾醇类物质，两种提取法中γ-谷甾醇的含量处理组相对于对照组均明显升高。有研究表明[18]在植物细胞膜内的植物甾醇与磷脂相互作用能够保持膜结构的稳定和调节细胞膜透性。植物甾醇参与植物对外界的胁迫反应，植物甾醇在植物抵抗许多不利因素（生物的和非生物的）的过程中发挥着重要作用[19]。同时，由表1可看出，二十一烷、二十九烷、三十烷等烷烃类物质均有所上升，烷烃类物质是植物表面蜡质层的组成部分，蜡质层是植物防御体系的重要组成部分，在防止病原物侵染、草食性昆虫及抵御环境胁迫如干旱、紫外线破坏和霜冻中发挥重要作用[20]。荔枝叶片在受到荔枝瘤瘿螨为害后，叶片内甾醇类物质以及烷烃类物质含量的升高是否参与了寄主抵御害虫为害的防御机制还需要进一步的试验验证。
参考文献
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