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摘 要：以不同分叉和同一分叉不同高度的千层塔原植物为材料，采用超声波辅助提取后利用高效液相色谱法对不同类别千层塔中石杉碱甲含量进行快速测定。结果显示，石杉碱甲的含量表现为叶片>茎>根部；分叉越多、植株越高，石杉碱甲含量越高；三分叉以上、相对比较高的千层塔植株石杉碱甲含量较高，是野外千层塔原药材采收的最佳类型。
关键词：千层塔；形态；分叉；石杉碱甲；高效液相色谱
中图分类号：S567.23+9.01文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）09-0036-03
千层塔（Huperzia serrata）为石杉科石杉属植物蛇足石杉的干燥全草，始载于《植物名实图考》，性味辛、苦、平，具有散瘀消肿、解毒和止痛的功效[1]。1972年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用[2]，之后大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂[3]。由于千层塔所具有的显著医疗作用和潜在的市场效益，1993年美国食品药物管理局（FDA）批准石杉碱甲片属类胆碱能剂，现已被国际上列为第二代乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂之一[4]。随着老龄化社会的到来，老年痴呆和记忆障碍成为临床迫切需要解决的问题[5]，石杉碱甲作为新型AChE抑制剂应用前景十分广阔，对千层塔的研究也受到了越来越多的关注[6]。
但是，野生千层塔生长缓慢[7]，当地人在采收时完全是“见者诛杀”，无论大小，走过之处，基本上无一生还。这样的采收，不仅导致采集的原药材质量良莠不齐，而且导致这一本身生长缓慢、数量不多的药用植物处于濒危的边缘。因此，给当地药民提供一个合理、适时采收千层塔的依据非常重要。本研究在千层塔快速检测工艺的基础上，对不同形态野生千层塔中石杉碱甲的含量进行测定、对比，从药材质量的角度提出合理采收千层塔的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 千层塔采于湖北恩施市盛家坝乡麻茶沟村龙塘沟组（34.2696576°N，109.1914236°E），由中国科学院植物研究所标本室鉴定为蛇足石杉（Huperzia serrata）。
1.1.2 试验仪器 KQ-500VDE台式三频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司，容量22.5 L，超声频率45 kHz，超声功率500 W，功率可调（40%～100%），时间可调（1～480 min）；Waters Alliance高效液相色谱仪；电子天平，北京赛多利斯天平仪器厂。
1.1.3 试剂 石杉碱甲标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100243-200401）；乙腈、甲醇为色谱纯（进口），水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 材料预处理 将采集的千层塔先用自来水冲洗掉表面附着物，然后按照不同的分叉数、同一分叉数按照不同的株高（5～10、10～15、15～20 cm）进行分类，用剪刀分离叶片、茎段和根，标记。将不同类别的材料放入烘箱（60℃）干燥至恒重。取出，研磨，过60目筛，备用。
1.2.2 待测样液制备 精确称取一定量的不同类型的千层塔粉末，加入2%酒石酸，放入超声清洗仪进行超声提取。超声完成后，用滤纸过滤至50 ml容量瓶，用2%酒石酸溶液定容，经0.22 μm有机滤膜过滤，滤液进行色谱测定。
1.2.3 超声提取时间的确定 精确称取一定量的三分叉千层塔叶片粉末6份，加入2%酒石酸，1份静置过夜作为对照，其余5份进行超声提取，超声时间分别为0.5、1、2、3、4 h。然后按照1.2.2的方法进行处理，HPLC测定，以确定石杉碱甲提取的最佳超声时间。
1.2.4 色谱条件 C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇+0.08 mol/L醋酸铵溶液（V/V=32∶8，用冰醋酸调pH至6.0）；流速1 ml/min；检测波长308 nm；柱温25℃；进样量20 μl。
1.2.5 标准曲线绘制 精确称取石杉碱甲对照品10 mg，甲醇溶解后定容至100 ml，然后用甲醇配制成5、10、20、40、80、100 mg/L的对照品溶液。分别进样20 μl，以峰面积与对应浓度绘制标准曲线，得回归方程：Y=6592.23654X+5.8330173，r=0.9993。
1.2.6 样液测定 按上述色谱条件，量取20 μl样液进样，记录峰面积，按线性回归方程计算石杉碱甲的含量。
2 结果与分析
2.1 超声时间对千层塔中石杉碱甲提取的影响
由表1可知，超声提取3 h，从三分叉千层塔叶片中测得的石杉碱甲含量最高，因此确定超声处理时间为3 h。
2.2 千层塔叶片、茎和根部石杉碱甲的含量比较
结果（表2）表明，对于三分叉的千层塔植株，叶片中石杉碱甲的含量最高，茎中次之，根部的石杉碱甲含量远低于叶片和茎中。
2.3 千层塔不同分叉数对石杉碱甲含量的影响
由表3可知，随着千层塔植株分叉数量的增多，叶片和茎中的石杉碱甲含量也随之增高，三分叉以上的植株中石杉碱甲的含量差异不大。
2.4 千层塔植株高度对石杉碱甲含量的影响
3 结论与讨论
超声波提取法的操作简单、成本低、效果好[8， 9]，但对不同实验室的具体操作过程而言又不完全相同。本试验通过比较不同的超声处理时间对千层塔中石杉碱甲含量的影响，确定最佳的超声处理时间为3 h，此时石杉碱甲提取率达到最大。在此基础上对不同分叉数、不同株高千层塔植株中石杉碱甲含量进行测定，结果表明，分叉越多、植株越高，其石杉碱甲的含量越高，多于三分叉的植株其石杉碱甲含量差别不大；千层塔地上部分的石杉碱甲含量明显高于地下部分，这与孙远明等[10]的研究结果一致。 因此，在千层塔的实际采收过程中应该遵循：（1）选择三分叉以上的高植株，不要采收分叉较少的植株；（2）尽可能不采挖根部，除因根部的石杉碱甲含量很低外，千层塔还可通过根部不定芽的形式进行自然繁殖。这对千层塔资源的保护性开发具有非常重要的指导意义。
参 考 文 献：
[1] 浙江省药用植物志编写组.浙江药用植物志[M].杭州：浙江科学技术出版社， 1980.
[2] 张君诚，邢建宏，宋育红，等.药用植物蛇足石杉研究新进展[J].中国野生植物资源， 2008， 27（2）： 1-4.
[3] Tang X C， He X C， Bai D L.Huperzine A： a novel acetylcholinesterase inhibitor [J]. Drugs Future， 1999， 24（6）：647-663.
[4] 王 斌， 何煦昌， 白东鲁.老年痴呆症药物石杉碱甲类似物研究（Ⅴ）.光学活性（-）-1-甲基石杉碱甲的全合成[J].药物学报， 1999， 34（6）： 434-438.
[5] Wolfe M S. Introduction to special issue on Alzheimer’s disease [J]. J. Med. Chem.， 2012， 55 （21）： 8977-8978.
[6] 郭 斌， 徐玲玲， 尉亚辉， 等.千层塔的研究进展[J].中国中药杂志， 2009， 34（16）： 2018-2023.
[7] Lindsley C W. Alzheimer’s disease： Development of disease-modifying treatments is the challenge for our generation [J]. ACS Chem. Neurosci.， 2012， 3 （11）： 804-805.
[8] 丁蕊艳， 李瑞菊， 陈子雷， 等. 气相色谱法测定棉籽中高效氯氰菊酯残留[J]. 山东农业科学， 2012， 44（8）： 116-118.
[9] 郭孝武. 一种提取中草药化学成分的方法——超声提取法[J]. 天然产物研究与开发， 1999， 11（3）： 37-34.
[10]孙远明， 余红英， 杨跃生， 等. HPLC法测定蛇足石杉中石杉碱甲含量[J]. 中草药， 2002， 33（12）： 1078-1080.
关键词：千层塔；形态；分叉；石杉碱甲；高效液相色谱
中图分类号：S567.23+9.01文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）09-0036-03
千层塔（Huperzia serrata）为石杉科石杉属植物蛇足石杉的干燥全草，始载于《植物名实图考》，性味辛、苦、平，具有散瘀消肿、解毒和止痛的功效[1]。1972年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用[2]，之后大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂[3]。由于千层塔所具有的显著医疗作用和潜在的市场效益，1993年美国食品药物管理局（FDA）批准石杉碱甲片属类胆碱能剂，现已被国际上列为第二代乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂之一[4]。随着老龄化社会的到来，老年痴呆和记忆障碍成为临床迫切需要解决的问题[5]，石杉碱甲作为新型AChE抑制剂应用前景十分广阔，对千层塔的研究也受到了越来越多的关注[6]。
但是，野生千层塔生长缓慢[7]，当地人在采收时完全是“见者诛杀”，无论大小，走过之处，基本上无一生还。这样的采收，不仅导致采集的原药材质量良莠不齐，而且导致这一本身生长缓慢、数量不多的药用植物处于濒危的边缘。因此，给当地药民提供一个合理、适时采收千层塔的依据非常重要。本研究在千层塔快速检测工艺的基础上，对不同形态野生千层塔中石杉碱甲的含量进行测定、对比，从药材质量的角度提出合理采收千层塔的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 千层塔采于湖北恩施市盛家坝乡麻茶沟村龙塘沟组（34.2696576°N，109.1914236°E），由中国科学院植物研究所标本室鉴定为蛇足石杉（Huperzia serrata）。
1.1.2 试验仪器 KQ-500VDE台式三频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司，容量22.5 L，超声频率45 kHz，超声功率500 W，功率可调（40%～100%），时间可调（1～480 min）；Waters Alliance高效液相色谱仪；电子天平，北京赛多利斯天平仪器厂。
1.1.3 试剂 石杉碱甲标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100243-200401）；乙腈、甲醇为色谱纯（进口），水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 材料预处理 将采集的千层塔先用自来水冲洗掉表面附着物，然后按照不同的分叉数、同一分叉数按照不同的株高（5～10、10～15、15～20 cm）进行分类，用剪刀分离叶片、茎段和根，标记。将不同类别的材料放入烘箱（60℃）干燥至恒重。取出，研磨，过60目筛，备用。
1.2.2 待测样液制备 精确称取一定量的不同类型的千层塔粉末，加入2%酒石酸，放入超声清洗仪进行超声提取。超声完成后，用滤纸过滤至50 ml容量瓶，用2%酒石酸溶液定容，经0.22 μm有机滤膜过滤，滤液进行色谱测定。
1.2.3 超声提取时间的确定 精确称取一定量的三分叉千层塔叶片粉末6份，加入2%酒石酸，1份静置过夜作为对照，其余5份进行超声提取，超声时间分别为0.5、1、2、3、4 h。然后按照1.2.2的方法进行处理，HPLC测定，以确定石杉碱甲提取的最佳超声时间。
1.2.4 色谱条件 C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇+0.08 mol/L醋酸铵溶液（V/V=32∶8，用冰醋酸调pH至6.0）；流速1 ml/min；检测波长308 nm；柱温25℃；进样量20 μl。
1.2.5 标准曲线绘制 精确称取石杉碱甲对照品10 mg，甲醇溶解后定容至100 ml，然后用甲醇配制成5、10、20、40、80、100 mg/L的对照品溶液。分别进样20 μl，以峰面积与对应浓度绘制标准曲线，得回归方程：Y=6592.23654X+5.8330173，r=0.9993。
1.2.6 样液测定 按上述色谱条件，量取20 μl样液进样，记录峰面积，按线性回归方程计算石杉碱甲的含量。
2 结果与分析
2.1 超声时间对千层塔中石杉碱甲提取的影响
由表1可知，超声提取3 h，从三分叉千层塔叶片中测得的石杉碱甲含量最高，因此确定超声处理时间为3 h。
2.2 千层塔叶片、茎和根部石杉碱甲的含量比较
结果（表2）表明，对于三分叉的千层塔植株，叶片中石杉碱甲的含量最高，茎中次之，根部的石杉碱甲含量远低于叶片和茎中。
2.3 千层塔不同分叉数对石杉碱甲含量的影响
由表3可知，随着千层塔植株分叉数量的增多，叶片和茎中的石杉碱甲含量也随之增高，三分叉以上的植株中石杉碱甲的含量差异不大。
2.4 千层塔植株高度对石杉碱甲含量的影响
3 结论与讨论
超声波提取法的操作简单、成本低、效果好[8， 9]，但对不同实验室的具体操作过程而言又不完全相同。本试验通过比较不同的超声处理时间对千层塔中石杉碱甲含量的影响，确定最佳的超声处理时间为3 h，此时石杉碱甲提取率达到最大。在此基础上对不同分叉数、不同株高千层塔植株中石杉碱甲含量进行测定，结果表明，分叉越多、植株越高，其石杉碱甲的含量越高，多于三分叉的植株其石杉碱甲含量差别不大；千层塔地上部分的石杉碱甲含量明显高于地下部分，这与孙远明等[10]的研究结果一致。 因此，在千层塔的实际采收过程中应该遵循：（1）选择三分叉以上的高植株，不要采收分叉较少的植株；（2）尽可能不采挖根部，除因根部的石杉碱甲含量很低外，千层塔还可通过根部不定芽的形式进行自然繁殖。这对千层塔资源的保护性开发具有非常重要的指导意义。
参 考 文 献：
[1] 浙江省药用植物志编写组.浙江药用植物志[M].杭州：浙江科学技术出版社， 1980.
[2] 张君诚，邢建宏，宋育红，等.药用植物蛇足石杉研究新进展[J].中国野生植物资源， 2008， 27（2）： 1-4.
[3] Tang X C， He X C， Bai D L.Huperzine A： a novel acetylcholinesterase inhibitor [J]. Drugs Future， 1999， 24（6）：647-663.
[4] 王 斌， 何煦昌， 白东鲁.老年痴呆症药物石杉碱甲类似物研究（Ⅴ）.光学活性（-）-1-甲基石杉碱甲的全合成[J].药物学报， 1999， 34（6）： 434-438.
[5] Wolfe M S. Introduction to special issue on Alzheimer’s disease [J]. J. Med. Chem.， 2012， 55 （21）： 8977-8978.
[6] 郭 斌， 徐玲玲， 尉亚辉， 等.千层塔的研究进展[J].中国中药杂志， 2009， 34（16）： 2018-2023.
[7] Lindsley C W. Alzheimer’s disease： Development of disease-modifying treatments is the challenge for our generation [J]. ACS Chem. Neurosci.， 2012， 3 （11）： 804-805.
[8] 丁蕊艳， 李瑞菊， 陈子雷， 等. 气相色谱法测定棉籽中高效氯氰菊酯残留[J]. 山东农业科学， 2012， 44（8）： 116-118.
[9] 郭孝武. 一种提取中草药化学成分的方法——超声提取法[J]. 天然产物研究与开发， 1999， 11（3）： 37-34.
[10]孙远明， 余红英， 杨跃生， 等. HPLC法测定蛇足石杉中石杉碱甲含量[J]. 中草药， 2002， 33（12）： 1078-1080.