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摘 要 以国兰杂交品种（系）为材料，采用L16（45）正交试验设计对Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、模板及引物等5个重要影响因素进行优化，确定国兰杂交品种（系）SRAP-PCR反应的最优反应体系为（25 μL体系）：Taq DNA聚合酶，1 U；Mg2+，1.8 mmol/L；dNTPs，0.08 mmol/L；模板DNA，100 ng；引物，上下游各0.3 mmol/L；10×PCR Buffer，2.5 μL。此外，本试验采用DNA混合池技术（DNA pooling）快速筛选SRAP引物，从180对SRAP引物组合中筛选出39对扩增产物丰富、多态性高的引物组合。与常规方法相比，该技术明显缩短试验周期、节约了模板用量，为快速高效筛选SRAP引物提供了新思路。
关键词 SRAP-PCR；体系优化；DNA混合池；引物筛选
中图分类号 S682.31 文献标识码 A
中国兰花又称国兰，一般是指兰属（Cymbidium）地生兰种类中具有较高观赏价值的一些种类， 包括春兰（C. goeringii）、蕙兰（C. faberi）、建兰（C. ensifolium）、墨兰（C. sinense）、寒兰（C. kanran）、莲瓣兰（C. tortisepalum）和春剑（C. tongibracteatum）7个种[1]。近年国兰种内及种间杂交已得到很大程度上的发展[2]。目前，国兰杂交品种（系）的研究较少，父母本多不明确，对品种分类及新品种选育带来诸多不便。
相关序列扩增多态性标记（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是2001年Li和Quiros开发的一种基于PCR的新型分子标记技术[3]，其引物设计独特，经PCR扩增，因不同个体内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性，具有操作简便、快速，多态性丰富，重复性好以及不需预知物种序列信息等优点。目前已广泛应用于植物的遗传多态性研究[4]、品种鉴定[5]、遗传连锁图谱构建[6]、测序以及基因克隆[7]等方面研究。利用SRAP分子标记对多种兰科植物进行分子鉴别、遗传多样性分析等方面研究也有相关报道[8-14]，但用于国兰杂交品种（系）研究罕有报道。通过SRAP分子标记分析，有助于已有国兰杂交品种（系）资的整理分类，鉴定亲本来源，对新品种选育有重要的指导意义。因此，本研究对国兰杂交品种（系）进行SRAP-PCR体系优化，为后期研究打下基础。
本研究拟采用L16（45）正交试验设计，对Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、模板及引物进行5因素4水平优化，建立国兰杂交品种（系）SRAP-PCR反应最优反应体系，为进一步研究奠定基础。常规引物筛选工作量大，耗时长。目前，DNA混合池技术在医学上有着广泛应用[15-16]，在植物分子标记引物筛选的应用比较少[17]，在SRAP分子标记引物筛选的应用未见报道。因此，本研究拟采用DNA混合池（DNA pooling）技术快速筛选SRAP引物，为SRAP引物快速高效筛选寻求新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
国兰杂交品种（系）样品均取自福建省连城兰花有限公司，取温室内一年生嫩叶3到4片放于装有变色硅胶的自封袋中， 移至-80 ℃冰箱保存备用。
试剂：Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、DL 2000 Marker、6×loading buffer均购自大连宝生物有限公司（Takara）。SRAP引物由上海生工生物有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取及检测 国兰杂交品种（系）基因组DNA的提取参照CTAB法[18]并进行改良。用1%琼脂糖凝胶电泳，电泳仪为Bio-RAD Powerpac Basic，用Bio-RAD GelDoc XR+凝胶成像系统进行成像分析。用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪检测DNA浓度与纯度，并用1×TE缓冲液将其稀释为50 ng/μL，-20 ℃保存备用。
1.2.4 常规SRAP引物筛选与快速筛选的对比分析
分别将C1、C2、C3和C4、C5、C6 6个国兰杂交品种（系）的基因组DNA等量混合，构建2个基因组DNA混合池。随机选取3对引物组合Me7/Em2、Me8/Em3、Me7/Em13，利用优化的体系分别对6个国兰杂交品种（系）及2个基因组DNA混合池进行PCR扩增。
1.2.5 DNA混合池引物快速筛选及验证 分别将C1、C2、C3，C4、C5、C6和C7、C8、C9 3组国兰杂交品种（系）的基因组DNA等量混合，构建3个基因组DNA混合池。为了提高混合池的筛选效应，各组中均选择在形态学性状上有较大差异的品种（系）。分别用这3个DNA混合池对180对引物组合进行筛选，扩增体系采用已优化体系。扩增产物经电泳染色后，选择扩增结果条带数量多，带型清晰的，多态性强的引物组合。
从所选引物中，随机选择一个引物组合对16个不同的国兰杂交品种（系）进行PCR扩增，检验引物筛选结果。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA的提取及检测
2.2 SRAP-PCR反应体系正交优化
经PCR扩增反应，L16（45）正交试验设计表的16个组合均能扩增出条带（图2）。但Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA浓度5种影响因子对扩增效果存在着明显影响。依据谱带的多态性、稳定性及强弱对 PCR 扩增结果依次打分[20]，条带数多、清晰、稳定的最佳产物计16分，最差的计1分，3次重复独立计分。
根据评分数据，用DPS软件计算各因素同一水平下试验值之和（Ki）及该水平的数据平均值（ki），同一因素的最大平均值减去最小平均值得极差R。极差R的大小反映了不同因素对反应体系的影响，R越大说明该因素对反应结果影响越大。由表4中R值可得，对国兰杂交品种（系）SRAP 反应体系的影响大小顺序依次为：Mg2+>引物> dNTPs>Taq DNA聚合酶>模板。在本试验中，正交表内Mg2+浓度最高的4组均出现了条带减少的现象，这可能是Mg2+与dNTPs结合，降低了dNTPs浓度所致。 每个因素水平下的数据平均值ki反映了该因素各水平对反应体系的影响情况，当ki值最大时的浓度水平为最佳反应体系。由表3可知，SRAP-PCR反应中5个影响因素的最佳水平为：Taq DNA聚合酶（5 U/μL），0.2 μL；Mg2+（15 mmol/L），3.0 μL；dNTPs（10 mmol/L），0.2 μL；模板DNA（50 ng/μL），1 μL；引物（10 mmol/L），上下游引物各0.75 μL。在所设计的正交表中，组合6与之接近，仅模板DNA浓度不一致。由R值可知，模板DNA浓度对SRAP-PCR反应体系的影响最小，但低浓度可能会导致条带不够清晰，高浓度浪费实验材料，本研究初步拟定100 ng/μL为最优模板DNA浓度。因此，本试验SRAP-PCR的最优反应体系（25 μL）确定为：Taq DNA聚合酶（5 U/μL），0.2 μL；Mg2+（15 mmol/L），3.0 μL；dNTPs（10 mmol/L），0.2 μL；模板DNA（50 ng/μL），2 μL；引物（10 mmol/L），上下游引物各0.75 μL，用高压双蒸水补足25 μL。
2.3 常规SRAP引物筛选与快速筛选的对比分析
DNA混合池能较好地代表其组成成分单独试验的结果。使用DNA混合池筛选引物，只需1次试验，便得到与多个单一样品DNA进行多次试验相同的效果，大大能减少试验次数，节约模板DNA用量，可达到快速筛选的目的。同时，在试验中常规引物筛与使用DNA混合池进行引物快速筛选的扩增效果基本一致，如引物Me7/Em2和Me7/Em13所扩增的4组；引物Me8/Em3的扩增结果中，常规引物筛选所得条带多态性较少，同样DNA混合池快速筛选的扩增效果也不理想。以上结果表明，可利用DNA混合池技术实现快速有效筛选SRAP引物的目的。
2.4 DNA混合池引物快速筛选及验证
3 讨论与结论
兰科植物多为珍稀濒危植物，全世界所有野生兰科植物均被列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》的保护范围[21]。国兰现有资源比较丰富，除几个传统国兰种类，春兰、蕙兰、建兰、墨兰和寒兰的优良品种间都可以进行交配[22]，因此，国兰人工新品种培育的道路比较宽广，种内种间杂交育种可能成为国兰选育新品种的新方向。前人比较了RAPD、SSR、ISSR和SRAP等4种分子标记技术，发现SRAP分子标记的多态性及区分能力最强[23]。
目前，已有不少关于SRAP-PCR 反应体系建立与优化的报道，多数研究采用单因素多水平分析法[24-26]。单因素多水平试验设计可以直观地了解各因素对SRAP-PCR反应的影响，但不能正确分析各因素间的相互作用。在PCR反应体系中，各个因素都会影响SRAP-PCR的扩增结果，而且各个因素之间往往存在相互影响。正交设计是根据统计学原理研究各因素不同水平交互作用的一种试验方法[27]，用正交设计法安排试验，具有均衡分散和整齐可比的特点，可以通过部分试验了解试验的全面情况，较快地找到最佳组合。本研究采用正交试验设计方法优化SRAP-PCR反应体系，得出较优的反应体系，试验结果也验证利用此反应体系的优良性，使试验更科学简便。
SRAP分子标记的引物是通用引物，引物筛选的结果直接影响下一步分析研究。目前，SRAP引物筛选部分采用单一样品DNA进行[28]。单次样品DNA筛选的引物代表性不高，尤其不适用于基因组差异较大的种间杂交品种的引物筛选。更多研究SRAP引物筛选是选用多个样品DNA进行多次筛选[29-30]，选用多个差异相对较大的样品DNA进行引物筛选，可以筛选出更加可靠的引物组合，但为保证有效性，其筛选工作量大，耗时长。DNA混合池技术是把多个样本的DNA溶液混在一起，进行PCR扩增，对组成混合池的样本数量没有固定要求，少到几个，多到几千都可以组成DNA混合池，它是一种切实有效，可以显著降低相关试验成本的技术手段[31]。
本研究首次使用DNA混合池技术进行国兰杂交品种（系）SRAP分子标记的引物筛选。从180对引物组合中，成功筛选出32对条带清晰且具多态性的引物组合。使用DNA混合池技术，只需1次混合模板试验便可以得到3次单独模板试验的效果，缩短了试验周期，节约了模板DNA的用量，同时提高了所选引物的可靠性。虽然DNA混合池对样本的数量没有要求[31]，然而DNA混合池的构成对快速筛选SRAP引物有着重要的影响，为确保所选得SRAP引物有更广的适用性，本试验的DNA混合池选用9个形态学性状相关较大的国兰杂交品种（系）DNA样品，分成3组进行等量混合，以保证各个样品在混合池中的浓度和数量，使得构建出来的3个DNA 混合池能够同等的代表其中的3个样品。电泳检测所得条带也充分显示出构建的DNA 混合池与3个样品的浓度和片段大小都比较一致，可以作为模板进行PCR扩增筛选引物。为了保证DNA混合池中各成分的浓度，本试验仅将3个样品混成混合池，至于更多样品混合，是否有更高的引物筛选效果，还有待进一步研究。
参考文献
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责任编辑：古小玲
关键词 SRAP-PCR；体系优化；DNA混合池；引物筛选
中图分类号 S682.31 文献标识码 A
中国兰花又称国兰，一般是指兰属（Cymbidium）地生兰种类中具有较高观赏价值的一些种类， 包括春兰（C. goeringii）、蕙兰（C. faberi）、建兰（C. ensifolium）、墨兰（C. sinense）、寒兰（C. kanran）、莲瓣兰（C. tortisepalum）和春剑（C. tongibracteatum）7个种[1]。近年国兰种内及种间杂交已得到很大程度上的发展[2]。目前，国兰杂交品种（系）的研究较少，父母本多不明确，对品种分类及新品种选育带来诸多不便。
相关序列扩增多态性标记（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是2001年Li和Quiros开发的一种基于PCR的新型分子标记技术[3]，其引物设计独特，经PCR扩增，因不同个体内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性，具有操作简便、快速，多态性丰富，重复性好以及不需预知物种序列信息等优点。目前已广泛应用于植物的遗传多态性研究[4]、品种鉴定[5]、遗传连锁图谱构建[6]、测序以及基因克隆[7]等方面研究。利用SRAP分子标记对多种兰科植物进行分子鉴别、遗传多样性分析等方面研究也有相关报道[8-14]，但用于国兰杂交品种（系）研究罕有报道。通过SRAP分子标记分析，有助于已有国兰杂交品种（系）资的整理分类，鉴定亲本来源，对新品种选育有重要的指导意义。因此，本研究对国兰杂交品种（系）进行SRAP-PCR体系优化，为后期研究打下基础。
本研究拟采用L16（45）正交试验设计，对Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、模板及引物进行5因素4水平优化，建立国兰杂交品种（系）SRAP-PCR反应最优反应体系，为进一步研究奠定基础。常规引物筛选工作量大，耗时长。目前，DNA混合池技术在医学上有着广泛应用[15-16]，在植物分子标记引物筛选的应用比较少[17]，在SRAP分子标记引物筛选的应用未见报道。因此，本研究拟采用DNA混合池（DNA pooling）技术快速筛选SRAP引物，为SRAP引物快速高效筛选寻求新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
国兰杂交品种（系）样品均取自福建省连城兰花有限公司，取温室内一年生嫩叶3到4片放于装有变色硅胶的自封袋中， 移至-80 ℃冰箱保存备用。
试剂：Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、DL 2000 Marker、6×loading buffer均购自大连宝生物有限公司（Takara）。SRAP引物由上海生工生物有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取及检测 国兰杂交品种（系）基因组DNA的提取参照CTAB法[18]并进行改良。用1%琼脂糖凝胶电泳，电泳仪为Bio-RAD Powerpac Basic，用Bio-RAD GelDoc XR+凝胶成像系统进行成像分析。用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪检测DNA浓度与纯度，并用1×TE缓冲液将其稀释为50 ng/μL，-20 ℃保存备用。
1.2.4 常规SRAP引物筛选与快速筛选的对比分析
分别将C1、C2、C3和C4、C5、C6 6个国兰杂交品种（系）的基因组DNA等量混合，构建2个基因组DNA混合池。随机选取3对引物组合Me7/Em2、Me8/Em3、Me7/Em13，利用优化的体系分别对6个国兰杂交品种（系）及2个基因组DNA混合池进行PCR扩增。
1.2.5 DNA混合池引物快速筛选及验证 分别将C1、C2、C3，C4、C5、C6和C7、C8、C9 3组国兰杂交品种（系）的基因组DNA等量混合，构建3个基因组DNA混合池。为了提高混合池的筛选效应，各组中均选择在形态学性状上有较大差异的品种（系）。分别用这3个DNA混合池对180对引物组合进行筛选，扩增体系采用已优化体系。扩增产物经电泳染色后，选择扩增结果条带数量多，带型清晰的，多态性强的引物组合。
从所选引物中，随机选择一个引物组合对16个不同的国兰杂交品种（系）进行PCR扩增，检验引物筛选结果。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA的提取及检测
2.2 SRAP-PCR反应体系正交优化
经PCR扩增反应，L16（45）正交试验设计表的16个组合均能扩增出条带（图2）。但Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA浓度5种影响因子对扩增效果存在着明显影响。依据谱带的多态性、稳定性及强弱对 PCR 扩增结果依次打分[20]，条带数多、清晰、稳定的最佳产物计16分，最差的计1分，3次重复独立计分。
根据评分数据，用DPS软件计算各因素同一水平下试验值之和（Ki）及该水平的数据平均值（ki），同一因素的最大平均值减去最小平均值得极差R。极差R的大小反映了不同因素对反应体系的影响，R越大说明该因素对反应结果影响越大。由表4中R值可得，对国兰杂交品种（系）SRAP 反应体系的影响大小顺序依次为：Mg2+>引物> dNTPs>Taq DNA聚合酶>模板。在本试验中，正交表内Mg2+浓度最高的4组均出现了条带减少的现象，这可能是Mg2+与dNTPs结合，降低了dNTPs浓度所致。 每个因素水平下的数据平均值ki反映了该因素各水平对反应体系的影响情况，当ki值最大时的浓度水平为最佳反应体系。由表3可知，SRAP-PCR反应中5个影响因素的最佳水平为：Taq DNA聚合酶（5 U/μL），0.2 μL；Mg2+（15 mmol/L），3.0 μL；dNTPs（10 mmol/L），0.2 μL；模板DNA（50 ng/μL），1 μL；引物（10 mmol/L），上下游引物各0.75 μL。在所设计的正交表中，组合6与之接近，仅模板DNA浓度不一致。由R值可知，模板DNA浓度对SRAP-PCR反应体系的影响最小，但低浓度可能会导致条带不够清晰，高浓度浪费实验材料，本研究初步拟定100 ng/μL为最优模板DNA浓度。因此，本试验SRAP-PCR的最优反应体系（25 μL）确定为：Taq DNA聚合酶（5 U/μL），0.2 μL；Mg2+（15 mmol/L），3.0 μL；dNTPs（10 mmol/L），0.2 μL；模板DNA（50 ng/μL），2 μL；引物（10 mmol/L），上下游引物各0.75 μL，用高压双蒸水补足25 μL。
2.3 常规SRAP引物筛选与快速筛选的对比分析
DNA混合池能较好地代表其组成成分单独试验的结果。使用DNA混合池筛选引物，只需1次试验，便得到与多个单一样品DNA进行多次试验相同的效果，大大能减少试验次数，节约模板DNA用量，可达到快速筛选的目的。同时，在试验中常规引物筛与使用DNA混合池进行引物快速筛选的扩增效果基本一致，如引物Me7/Em2和Me7/Em13所扩增的4组；引物Me8/Em3的扩增结果中，常规引物筛选所得条带多态性较少，同样DNA混合池快速筛选的扩增效果也不理想。以上结果表明，可利用DNA混合池技术实现快速有效筛选SRAP引物的目的。
2.4 DNA混合池引物快速筛选及验证
3 讨论与结论
兰科植物多为珍稀濒危植物，全世界所有野生兰科植物均被列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》的保护范围[21]。国兰现有资源比较丰富，除几个传统国兰种类，春兰、蕙兰、建兰、墨兰和寒兰的优良品种间都可以进行交配[22]，因此，国兰人工新品种培育的道路比较宽广，种内种间杂交育种可能成为国兰选育新品种的新方向。前人比较了RAPD、SSR、ISSR和SRAP等4种分子标记技术，发现SRAP分子标记的多态性及区分能力最强[23]。
目前，已有不少关于SRAP-PCR 反应体系建立与优化的报道，多数研究采用单因素多水平分析法[24-26]。单因素多水平试验设计可以直观地了解各因素对SRAP-PCR反应的影响，但不能正确分析各因素间的相互作用。在PCR反应体系中，各个因素都会影响SRAP-PCR的扩增结果，而且各个因素之间往往存在相互影响。正交设计是根据统计学原理研究各因素不同水平交互作用的一种试验方法[27]，用正交设计法安排试验，具有均衡分散和整齐可比的特点，可以通过部分试验了解试验的全面情况，较快地找到最佳组合。本研究采用正交试验设计方法优化SRAP-PCR反应体系，得出较优的反应体系，试验结果也验证利用此反应体系的优良性，使试验更科学简便。
SRAP分子标记的引物是通用引物，引物筛选的结果直接影响下一步分析研究。目前，SRAP引物筛选部分采用单一样品DNA进行[28]。单次样品DNA筛选的引物代表性不高，尤其不适用于基因组差异较大的种间杂交品种的引物筛选。更多研究SRAP引物筛选是选用多个样品DNA进行多次筛选[29-30]，选用多个差异相对较大的样品DNA进行引物筛选，可以筛选出更加可靠的引物组合，但为保证有效性，其筛选工作量大，耗时长。DNA混合池技术是把多个样本的DNA溶液混在一起，进行PCR扩增，对组成混合池的样本数量没有固定要求，少到几个，多到几千都可以组成DNA混合池，它是一种切实有效，可以显著降低相关试验成本的技术手段[31]。
本研究首次使用DNA混合池技术进行国兰杂交品种（系）SRAP分子标记的引物筛选。从180对引物组合中，成功筛选出32对条带清晰且具多态性的引物组合。使用DNA混合池技术，只需1次混合模板试验便可以得到3次单独模板试验的效果，缩短了试验周期，节约了模板DNA的用量，同时提高了所选引物的可靠性。虽然DNA混合池对样本的数量没有要求[31]，然而DNA混合池的构成对快速筛选SRAP引物有着重要的影响，为确保所选得SRAP引物有更广的适用性，本试验的DNA混合池选用9个形态学性状相关较大的国兰杂交品种（系）DNA样品，分成3组进行等量混合，以保证各个样品在混合池中的浓度和数量，使得构建出来的3个DNA 混合池能够同等的代表其中的3个样品。电泳检测所得条带也充分显示出构建的DNA 混合池与3个样品的浓度和片段大小都比较一致，可以作为模板进行PCR扩增筛选引物。为了保证DNA混合池中各成分的浓度，本试验仅将3个样品混成混合池，至于更多样品混合，是否有更高的引物筛选效果，还有待进一步研究。
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责任编辑：古小玲