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科研项目 河南省教育厅自然科学研究项目(项目批准编号2007320020)
摘 要 目的:研究不同类型关节炎患者血清中葡萄糖-6-磷酸异构酶(G6PI)抗原含量和酶活性水平的差异,观察类风湿关节炎(RA)患者血清中G6PI抗原含量和活性是否有相关性,探讨RA患者G6PI抗原含量升高机制。方法:对172例临床已确诊的不同类型关节炎患者和20例健康人,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和速率法分别测定各例患者血清中G6PI抗原含量和酶活性。结果:56例RA患者血清中G6PI抗原含量为3.009μg/ml,活性為164.575U/L;116例非RA关节炎患者血清中G6PI抗原含量为0.019μg/ml,活性为65.6U/L;健康对照组血清中G6PI抗原含量为0.0135μg/ml,活性为67.72U/L。结论:RA患者与其他关节炎患者相比,G6PI抗原含量显著增高,有诊断价值;RA患者G6PI抗原含量和活性之间无相关性,r=0.007;G6PI活性:SLE>AS>RA>其他关节炎;用免疫方法检出的G6PI可能是具有酶活性G6PI的互补蛋白。
关键词 关节炎 葡萄糖-6-磷酸异构酶 含量活性 互补蛋白
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2009.20.243
资料与方法
标本:来自本院风湿实验室血清库和郑州大学第一附属医院肾病风湿科。已确诊的RA患者56例,强直性脊柱炎(AS)25例,系统性红斑狼疮(SLE)25例,晶体性关节炎(Crys.原发性痛风)20例,骨性关节炎(OA)20例,外伤性关节炎(Tr)22例,结核性关节炎(TB)4例。
将172例分为两组:①类风湿关节炎患者。②非类风湿关节炎患者:包括包括强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、原发性痛风、骨性关节炎、外伤性关节炎、结核性关节炎。所有风湿病患者均符合美国风湿病协会(ACR)修订的诊断分类标准。选择20例健康人血清作为正常对照。
试剂:北加生化试剂有限公司生产的G6PI抗原ELISA含量测定试剂盒;汇力生物技术有限公司生产的G6PI活性测定试剂盒。
采用ELISA双抗体夹心法检测人血清中的G6PI抗原含量。将172例患者和20例健康人血标本编号,离心,分离血清。操作步骤:在已包被G6PI抗体的聚苯乙烯微孔板上设G6PI标准品5孔及空白孔1孔,其余依次加待检人血清样品,每孔加样100μl。37℃放置1小时,取出洗涤5次,拍干。除空白孔外,其余各孔加酶标记抗体100μl,37℃放置1小时,取出洗涤5次,拍干。各孔加底物显色液100μl,室温避光保持15 分钟。各孔加终止液50μl。结果判断:采用奥地利HT3型自动酶标仪主波长492nm,副波长620nm,以G6PI标准品0.00mg/L校零,测定各孔吸光度值,以G6PI标准品标示值为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线(标准曲线见图)。以待检各孔吸光度值查标准曲线,得出相应的检测结果。超过线性范围时,对血清稀释结果×稀释倍数。酶标仪采用安图生物工程有限公司配套电脑软件。
测定血清G6PI活性的方法:原理:果糖-6-磷酸-G6PI→葡萄糖-6-磷酸;葡萄糖-6-磷酸+NADP→NADPH。在340nm波长,测定每分钟NADPH的吸光度变化值乘以因数计算活性。以国际单位表示。
测量参数:样品量25μl,试剂量500μl,反应方向正,测量时间60秒,延迟时间60秒,温度37℃,波长340nm,因数3333。在日本岛津CL-770自动分光光度计上操作。参考范围:8～54U/L。
统计学处理:用SPSS13.0软件进行统计学分析,由于血清中的G6PI不属于正态分布,用秩和检验对数据进行分析。
结 果
不同组血清中G6PI抗原含量,见表1。
如表所示:RA患者G6PI抗原含量均值显著高于非类风湿关节炎和健康对照,非类风湿关节炎各组G6PI抗原含量变化不大。
不同组血清中G6PI活性,见表2。结果显示:SLE患者血清中的G6PI活性为201.60U/L显著高于RA患者活性164.575U/L和AS患者活性188.70U/L;RA患者与AS患者G6PI活性无明显差别(P﹥0.05);RA患者与健康对照组G6PI活性无明显差别(P≥0.05);RA,AS,SLE三组病人G6PI活性与OA,Tr,TB,Crys患者相比有显著性差异(P=0.000),RA与非RA患者G6PI活性有显著性差异(P=0.000)。
RA患者G6PI活性与G6PI抗原含量采用pearson检验,r=0.007,P=0.959,无统计学意义,可见RA患者G6PI活性与G6PI抗原无相关性。
讨 论
2001年Schaller等首次报道抗葡萄糖-6-磷酸异构酶(G6PI)G6PI作为一种酶,在RA患者血清中其酶活性是否升高,与G6PI抗原含量之间是否有相关性,G6PI在其他一些关节疾病如原发性痛风、骨性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮等疾病中含量和活性是否升高,国内尚未见报道。
本文采用ELISA双抗体夹心法和速率法同步检测不同类型关节炎患者血清G6PI抗原的含量和G6PI酶活性。结果发现,RA患者G6PI抗原含量均值显著高于非类风湿关节炎和健康对照。非类风湿关节炎各组G6PI抗原含量变化不大。SLE患者血清中的G6PI活性为201.60U/L显著高于RA患者活性164.575U/L和AS患者活性188.70U/L;RA患者与AS患者G6PI活性无明显差别;RA患者与健康对照组G6PI活性无明显差别;RA、AS、SLE三组病人G6PI活性与OA、Tr、TB、Crys患者相比差异有显著性(P=0.000),RA与非RA患者G6PI活性有显著性差异(P=0.000)。RA患者G6PI活性与G6PI抗原含量采用pearson相关分析,无相关性,r=0.007,P=0.959,RA患者G6PI活性与G6PI抗原含量无统计学意义。此结果与Monica Schaller等[4]报道一致。
G6PI作为细胞因子和生长因子参与一系列广泛的胞外代谢。G6PI的多种细胞外功能包括:提高运动和感官神经元在体外的存活率;刺激B细胞产生免疫球蛋白;是肿瘤细胞的产物,促进肿瘤细胞的转移;有助于原始粒细胞和成熟单核细胞的鉴别;是精子发生凝聚的主要表面抗原物质。G6PI为何有这么广泛的功能目前还不太清楚。G6PI的基因位于第19号染色体上,基因全长超过40Kb,含有18个外显子和17个内含子。根据T细胞受体转基因小鼠(K/B×N)模型,G6PI作为一种自身抗原诱导T细胞和B细胞产生抗G6PI抗体,被动转移抗G6PI自身抗体可引起接种动物关节炎,G6PI同时作为自身抗原与抗G6PI自身抗体结合形成免疫复合物,引起关节症状的进一步加重。虽然抗G6PI抗体可能对RA的诊断无帮助,但RA病人血清和关节液中明显增高的G6PI抗原可能对RA的诊断有帮助,或者能成为RA病人病情活动指标之一。本文通过一系列试验及数据整理分析,发现与其他非类风湿关节炎患者相比,RA患者G6PI抗原含量明显升高,支持多位学者G6PI抗原含量检测可用于诊断RA的结论。发现RA,AS,SLE三组病人G6PI活性与OA,Tr,TB,Crys患者相比有显著性差异(P﹤0.01),确切原因不清,可能是因自身免疫因素所致关节炎患者基因调控紊乱或糖酵解加强导致G6PI合成增加,从而活性增加。此外,G6PI是一糖代谢酶,缺氧增加了炎症相关的新陈代谢需求,细胞增殖超过了血管生成,血供减少更引起了炎症,从而加重RA的病情。G6PI活性:SLE>AS>RA>其他关节炎。G6PI活性检测似可作为RA等自身免疫因素所致关节炎患者炎性程度的一个指标。
G6PI抗原含量和活性之间并无明显相关性。分析有一下原因:①G6PI在血清中的存在形式有三种:四聚体,二聚体和单体,仅二聚体形式有酶活性,单体形式的G6PI是一种细胞活性因子。G6PI是B淋巴细胞和T淋巴细胞分泌的一种自身抗原,与免疫因素密切相关,当各种形式的G6PI形成抗原抗体免疫复合物时就失去了活性。而RA患者血清和关节液中含有大量的G6PI免疫复合物,这类G6PI在酶活性试验中就无法测出。而用ELISA法检测G6PI含量时测出的则是所有含G6PI的多种形式的G6PI,因此含量往往升高。②根据Pendergraft等自身免疫病发病机制独特型网络理论,还可有另外一種解释,用免疫方法检出的G6PI是具有酶活性的G6PI的互补蛋白,是由具有酶活性的G6PI基因的反义链编码的蛋白。尤其是那些由-1读码框架转录翻译而来的蛋白。这种互补蛋白可以由内源性的反义或者由外源性的细菌或真菌的自身抗原(G6PI)编码同源序列翻译生成。这种互补蛋白诱发独特型-抗独特型抗体网络反应,产生的抗独特型抗体能够与自身抗原反应从而诱发自身免疫性疾病——RA。这个独特型-抗独特型抗体网络过程被称为“自身抗原互补性”。换言之,导致自身免疫病(RA)的级联事件的起始物是内原性或外原性“G6PI”的互补蛋白。本文结果支持这一理论。用免疫方法检出的这种只在RA患者血清中检出的所谓“葡萄糖-6-磷酸异构酶,G6PI”与参与糖代谢的“葡萄糖-6-磷酸异构酶,G6PI”不是一种物质。RA患者血清中“G6PI”应称为葡萄糖-6-磷酸异构酶互补蛋白,G6PI互补(反义)蛋白。参与糖代谢的G6PI才是真正的“葡萄糖-6-磷酸异构酶”。
参考文献
1 Schaller M,Burton DR,Ditzel HJ.Autoantibodies to GPI in rheumatoid arthritis:linkage between an animal model and human disease.Nat Immunol,2001,2(8):746-753.
2 鲍春德,叶萍,陈晓翔,等.血清中6-磷酸葡萄糖异构酶抗原升高在类风湿关节炎中的意义探讨.中华风湿病学杂志,2005,9(5):277-279.
3 郭品娥,沈茜,郝怡鑫,等.血清6-磷酸葡萄糖异构酶水平对类风湿关节炎的诊断价值.诊断学理论与实践,2005,4(6):466-468.
4 李军,魏署亚,侯蓉,等.磷酸己糖异构酶测定方法的改进及对恶性肿瘤诊断价值的探讨.肿瘤防治杂志2000,7(5):449.
摘 要 目的:研究不同类型关节炎患者血清中葡萄糖-6-磷酸异构酶(G6PI)抗原含量和酶活性水平的差异,观察类风湿关节炎(RA)患者血清中G6PI抗原含量和活性是否有相关性,探讨RA患者G6PI抗原含量升高机制。方法:对172例临床已确诊的不同类型关节炎患者和20例健康人,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和速率法分别测定各例患者血清中G6PI抗原含量和酶活性。结果:56例RA患者血清中G6PI抗原含量为3.009μg/ml,活性為164.575U/L;116例非RA关节炎患者血清中G6PI抗原含量为0.019μg/ml,活性为65.6U/L;健康对照组血清中G6PI抗原含量为0.0135μg/ml,活性为67.72U/L。结论:RA患者与其他关节炎患者相比,G6PI抗原含量显著增高,有诊断价值;RA患者G6PI抗原含量和活性之间无相关性,r=0.007;G6PI活性:SLE>AS>RA>其他关节炎;用免疫方法检出的G6PI可能是具有酶活性G6PI的互补蛋白。
关键词 关节炎 葡萄糖-6-磷酸异构酶 含量活性 互补蛋白
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2009.20.243
资料与方法
标本:来自本院风湿实验室血清库和郑州大学第一附属医院肾病风湿科。已确诊的RA患者56例,强直性脊柱炎(AS)25例,系统性红斑狼疮(SLE)25例,晶体性关节炎(Crys.原发性痛风)20例,骨性关节炎(OA)20例,外伤性关节炎(Tr)22例,结核性关节炎(TB)4例。
将172例分为两组:①类风湿关节炎患者。②非类风湿关节炎患者:包括包括强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、原发性痛风、骨性关节炎、外伤性关节炎、结核性关节炎。所有风湿病患者均符合美国风湿病协会(ACR)修订的诊断分类标准。选择20例健康人血清作为正常对照。
试剂:北加生化试剂有限公司生产的G6PI抗原ELISA含量测定试剂盒;汇力生物技术有限公司生产的G6PI活性测定试剂盒。
采用ELISA双抗体夹心法检测人血清中的G6PI抗原含量。将172例患者和20例健康人血标本编号,离心,分离血清。操作步骤:在已包被G6PI抗体的聚苯乙烯微孔板上设G6PI标准品5孔及空白孔1孔,其余依次加待检人血清样品,每孔加样100μl。37℃放置1小时,取出洗涤5次,拍干。除空白孔外,其余各孔加酶标记抗体100μl,37℃放置1小时,取出洗涤5次,拍干。各孔加底物显色液100μl,室温避光保持15 分钟。各孔加终止液50μl。结果判断:采用奥地利HT3型自动酶标仪主波长492nm,副波长620nm,以G6PI标准品0.00mg/L校零,测定各孔吸光度值,以G6PI标准品标示值为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线(标准曲线见图)。以待检各孔吸光度值查标准曲线,得出相应的检测结果。超过线性范围时,对血清稀释结果×稀释倍数。酶标仪采用安图生物工程有限公司配套电脑软件。
测定血清G6PI活性的方法:原理:果糖-6-磷酸-G6PI→葡萄糖-6-磷酸;葡萄糖-6-磷酸+NADP→NADPH。在340nm波长,测定每分钟NADPH的吸光度变化值乘以因数计算活性。以国际单位表示。
测量参数:样品量25μl,试剂量500μl,反应方向正,测量时间60秒,延迟时间60秒,温度37℃,波长340nm,因数3333。在日本岛津CL-770自动分光光度计上操作。参考范围:8～54U/L。
统计学处理:用SPSS13.0软件进行统计学分析,由于血清中的G6PI不属于正态分布,用秩和检验对数据进行分析。
结 果
不同组血清中G6PI抗原含量,见表1。
如表所示:RA患者G6PI抗原含量均值显著高于非类风湿关节炎和健康对照,非类风湿关节炎各组G6PI抗原含量变化不大。
不同组血清中G6PI活性,见表2。结果显示:SLE患者血清中的G6PI活性为201.60U/L显著高于RA患者活性164.575U/L和AS患者活性188.70U/L;RA患者与AS患者G6PI活性无明显差别(P﹥0.05);RA患者与健康对照组G6PI活性无明显差别(P≥0.05);RA,AS,SLE三组病人G6PI活性与OA,Tr,TB,Crys患者相比有显著性差异(P=0.000),RA与非RA患者G6PI活性有显著性差异(P=0.000)。
RA患者G6PI活性与G6PI抗原含量采用pearson检验,r=0.007,P=0.959,无统计学意义,可见RA患者G6PI活性与G6PI抗原无相关性。
讨 论
2001年Schaller等首次报道抗葡萄糖-6-磷酸异构酶(G6PI)G6PI作为一种酶,在RA患者血清中其酶活性是否升高,与G6PI抗原含量之间是否有相关性,G6PI在其他一些关节疾病如原发性痛风、骨性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮等疾病中含量和活性是否升高,国内尚未见报道。
本文采用ELISA双抗体夹心法和速率法同步检测不同类型关节炎患者血清G6PI抗原的含量和G6PI酶活性。结果发现,RA患者G6PI抗原含量均值显著高于非类风湿关节炎和健康对照。非类风湿关节炎各组G6PI抗原含量变化不大。SLE患者血清中的G6PI活性为201.60U/L显著高于RA患者活性164.575U/L和AS患者活性188.70U/L;RA患者与AS患者G6PI活性无明显差别;RA患者与健康对照组G6PI活性无明显差别;RA、AS、SLE三组病人G6PI活性与OA、Tr、TB、Crys患者相比差异有显著性(P=0.000),RA与非RA患者G6PI活性有显著性差异(P=0.000)。RA患者G6PI活性与G6PI抗原含量采用pearson相关分析,无相关性,r=0.007,P=0.959,RA患者G6PI活性与G6PI抗原含量无统计学意义。此结果与Monica Schaller等[4]报道一致。
G6PI作为细胞因子和生长因子参与一系列广泛的胞外代谢。G6PI的多种细胞外功能包括:提高运动和感官神经元在体外的存活率;刺激B细胞产生免疫球蛋白;是肿瘤细胞的产物,促进肿瘤细胞的转移;有助于原始粒细胞和成熟单核细胞的鉴别;是精子发生凝聚的主要表面抗原物质。G6PI为何有这么广泛的功能目前还不太清楚。G6PI的基因位于第19号染色体上,基因全长超过40Kb,含有18个外显子和17个内含子。根据T细胞受体转基因小鼠(K/B×N)模型,G6PI作为一种自身抗原诱导T细胞和B细胞产生抗G6PI抗体,被动转移抗G6PI自身抗体可引起接种动物关节炎,G6PI同时作为自身抗原与抗G6PI自身抗体结合形成免疫复合物,引起关节症状的进一步加重。虽然抗G6PI抗体可能对RA的诊断无帮助,但RA病人血清和关节液中明显增高的G6PI抗原可能对RA的诊断有帮助,或者能成为RA病人病情活动指标之一。本文通过一系列试验及数据整理分析,发现与其他非类风湿关节炎患者相比,RA患者G6PI抗原含量明显升高,支持多位学者G6PI抗原含量检测可用于诊断RA的结论。发现RA,AS,SLE三组病人G6PI活性与OA,Tr,TB,Crys患者相比有显著性差异(P﹤0.01),确切原因不清,可能是因自身免疫因素所致关节炎患者基因调控紊乱或糖酵解加强导致G6PI合成增加,从而活性增加。此外,G6PI是一糖代谢酶,缺氧增加了炎症相关的新陈代谢需求,细胞增殖超过了血管生成,血供减少更引起了炎症,从而加重RA的病情。G6PI活性:SLE>AS>RA>其他关节炎。G6PI活性检测似可作为RA等自身免疫因素所致关节炎患者炎性程度的一个指标。
G6PI抗原含量和活性之间并无明显相关性。分析有一下原因:①G6PI在血清中的存在形式有三种:四聚体,二聚体和单体,仅二聚体形式有酶活性,单体形式的G6PI是一种细胞活性因子。G6PI是B淋巴细胞和T淋巴细胞分泌的一种自身抗原,与免疫因素密切相关,当各种形式的G6PI形成抗原抗体免疫复合物时就失去了活性。而RA患者血清和关节液中含有大量的G6PI免疫复合物,这类G6PI在酶活性试验中就无法测出。而用ELISA法检测G6PI含量时测出的则是所有含G6PI的多种形式的G6PI,因此含量往往升高。②根据Pendergraft等自身免疫病发病机制独特型网络理论,还可有另外一種解释,用免疫方法检出的G6PI是具有酶活性的G6PI的互补蛋白,是由具有酶活性的G6PI基因的反义链编码的蛋白。尤其是那些由-1读码框架转录翻译而来的蛋白。这种互补蛋白可以由内源性的反义或者由外源性的细菌或真菌的自身抗原(G6PI)编码同源序列翻译生成。这种互补蛋白诱发独特型-抗独特型抗体网络反应,产生的抗独特型抗体能够与自身抗原反应从而诱发自身免疫性疾病——RA。这个独特型-抗独特型抗体网络过程被称为“自身抗原互补性”。换言之,导致自身免疫病(RA)的级联事件的起始物是内原性或外原性“G6PI”的互补蛋白。本文结果支持这一理论。用免疫方法检出的这种只在RA患者血清中检出的所谓“葡萄糖-6-磷酸异构酶,G6PI”与参与糖代谢的“葡萄糖-6-磷酸异构酶,G6PI”不是一种物质。RA患者血清中“G6PI”应称为葡萄糖-6-磷酸异构酶互补蛋白,G6PI互补(反义)蛋白。参与糖代谢的G6PI才是真正的“葡萄糖-6-磷酸异构酶”。
参考文献
1 Schaller M,Burton DR,Ditzel HJ.Autoantibodies to GPI in rheumatoid arthritis:linkage between an animal model and human disease.Nat Immunol,2001,2(8):746-753.
2 鲍春德,叶萍,陈晓翔,等.血清中6-磷酸葡萄糖异构酶抗原升高在类风湿关节炎中的意义探讨.中华风湿病学杂志,2005,9(5):277-279.
3 郭品娥,沈茜,郝怡鑫,等.血清6-磷酸葡萄糖异构酶水平对类风湿关节炎的诊断价值.诊断学理论与实践,2005,4(6):466-468.
4 李军,魏署亚,侯蓉,等.磷酸己糖异构酶测定方法的改进及对恶性肿瘤诊断价值的探讨.肿瘤防治杂志2000,7(5):449.