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摘要：从湖南省常德地区的3个不同鸡场采集105份病料，通过细菌分离和生化鉴定共分离得到75株鸡源性大肠杆菌，其中60株为致病性大肠杆菌。对分离得到的75株雞大肠杆菌进行30种抗生素的敏感性试验表明，分离菌株对30种抗菌药物均有不同程度的耐药性，且多重耐药现象普遍；在30种受试药物中，高敏的药物分别为头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢唑啉、头孢噻肟、丁胺卡那霉素等6种。
关键词：鸡；致病性大肠杆菌；耐药性
中图分类号： S852.61+2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0226-03
收稿日期：2013-10-10
基金项目：湖南省“十二五”重点建设学科（动物学）项目（编号：湘教发[2011]76 号）；湖南省高校科技创新团队项目（编号：2008244）；湖南省动物学重点实验室项目（编号：200824632）；湖南文理学院青年专项基金（编号：QNYX0811）。
作者简介：李娜（1977—），女，吉林长春人，硕士，讲师，研究方向为预防兽医学。E-mail：vetlina@163.com。大肠杆菌为临床上常见的病原菌，在腹泻畜禽的粪便中及各种原因引起的败血症畜禽中都能分离到致病性大肠杆菌。该病的主要特征包括心包炎、肝周炎、脐炎、气囊炎、败血症、眼炎、滑膜炎、卵黄性腹膜炎等，多继发新城疫、传染性喉气管炎等疾病，导致鸡群高死亡率，对养鸡生产的危害极大[1]。国内已有很多关于鸡大肠杆菌病流行病学的研究报道，主要针对我国的主要省（市），而对较小的市、县的研究报道并不多。由于大肠杆菌血清型多、抗原复杂，在小区域间也存在较大差异；同时随着抗生素的广泛应用，大肠杆菌的耐药性越来越强。为了能准确防治鸡大肠杆菌病，应在尽可能小的区域内对其进行病原血清型调查，并合理用药。目前，国内尚无对湖南省常德地区鸡场大肠杆菌耐药性监测的调查研究报道。为此，笔者从2006年10月至2012年12月对湖南省常德地区范围内的鸡大肠杆菌病流行情况和耐药情况进行了调查和监测，以了解湖南省常德地区的主要流行菌株的耐药规律，为兽医临床用药提供指导性参考意见。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1病料采集在2006年10月至2012年12月期间，选取105份湖南省常德地区饲养的疑似大肠杆菌病鸡的脏器。
1.1.2培养基及试剂普通琼脂平板培养基、三糖铁（TSI）琼脂培养基、伊红美兰（EMB）琼脂培养基、麦康凯（MAC）琼脂培养基，购自北京奥博星生物技术责任有限公司；生化试验微量发酵管，购自杭州微生物试剂有限公司；普通营养肉汤，自制。
1.1.3试验动物18～25 g/只的小白鼠，购自湖南农业大学小动物室。
1.1.4药敏纸片试验用药敏纸片共30种，包括阿莫西林、哌拉西林、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氨苄青霉素、苯唑青霉素、妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素、头孢哌酮、头孢他啶、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松、头孢氨苄、四环素、氯霉素、红霉素、新霉素、壮观霉素、强力霉素、林可霉素、乙酰螺旋霉素、氯洁霉素、呋喃妥因、氨曲南、复方新诺明、利福平等，购于杭州天和微生物试剂有限公司。
1.2试验方法
1.2.1细菌形态与分离培养将采集的新鲜病料分别划线接种于普通培养基、MAC、EMB培养基上，同时分别穿刺TSI琼脂管，置于37 ℃恒温箱培养18～24 h后观察；挑取疑似的单个菌落进行革兰氏染色镜检，将培养特性及形态、染色反应、排列均符合大肠杆菌特征的菌株划线接种于普通营养琼脂平板上进行细菌的数次纯化，然后将纯化的细菌接种于普通斜面培养基上，4 ℃保存备用。
1.2.2生化特性鉴定将分离的60个致病菌株接种于普通肉汤中，37 ℃恒温箱培养24～48 h后适量接种于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、尿素、H2S、靛基质、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、MR、VP微量发酵管中，置于37 ℃恒温箱培养24 h后观察生化反应结果。靛基质发酵管中滴加1滴靛基质试剂、MR发酵管中滴加1滴MR试剂即可观察结果；VP发酵管中滴加2滴VP甲液、1滴VP乙液，置于37 ℃培养2 h即可观察结果。
1.2.3大肠杆菌致病性试验取已鉴定的、生化反应符合大肠杆菌的各个菌株于37 ℃恒温箱培养18 h的普通肉汤培养物（菌液浓度为3.0×109 CFU/mL），经纯粹检验合格后分别腹腔接种18～25 g小白鼠，按0.2 mL/只的剂量接种，每个菌株接种6只；对照组按相同的途径接种0.2 mL普通肉汤培养液，共接种6只。接种后饲养观察120 h小白鼠的存活情况，记录小白鼠的死亡时间并对死亡小白鼠进行剖检取肝脏、心脏，用EMB平板进行接种菌回收试验以分离致病菌。
1.2.4分离菌药物敏感性试验采用WHO推荐的 Kriby-Bauer （K-B）法[2]对分离鉴定的75株大肠杆菌进行耐药性监测，判断标准参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁布的M100-S15药敏试验纸片扩散法法规[2]和相关文献[3-4]，以高敏、中敏、低敏或耐药3种形式对抑菌圈大小作出判定。先将菌株接种到普通营养琼脂斜面培养基上，37 ℃ 恒温箱培养18 h，用生理盐水洗下菌苔；将菌悬液稀释到麦氏比浊管中，相当于终浓度5×107～1×108 CFU/mL；将普通营养琼脂倾注于直径为10 cm的平皿上，制成厚4 mm的营养琼脂平板，15 min内用灭菌棉拭子蘸取上述浓度的菌悬液，在管内壁挤去多余菌液后在琼脂平板表面涂布接种3次，每次旋转70°，最后沿平板内缘涂抹1周；室温干燥3～5 min后，用无菌镊子将药敏纸片紧贴于营养琼脂平板表面，各纸片中心的距离应大于24 mm，纸片距平板内缘的距离应大于 15 mm；37 ℃恒温箱培养16～18 h后观察结果，记录各纸片的抑菌圈直径。 2结果与分析
2.1细菌形态及生长情况
由细菌培养结果可知，在普通營养琼脂平板上的菌落生长良好、湿润，呈现半透明状态与灰白色，边缘光滑；在EMB琼脂培养基平板上的细菌形成中等大小、边缘整齐、表面光滑、黑紫色带金属光泽的菌落；在MAC琼脂培养基平板上的细菌长出圆形粉红色、表面光滑圆形中等大小的菌落；TSI管底及斜面培养的细菌均变黄色，产气而不产硫化氢；经过革兰氏染色镜检后，镜下均可见大量散在的红色、中等大小、两端钝圆的无芽孢G-短小直杆菌。
2.2分离菌的生化特性
分别对分离出的60株致病细菌进行生化试验，结果均符合大肠杆菌的生化特性，详见表1。
2.3大肠杆菌致病性试验
小白鼠在接种分离菌12 h后，均表现出精神不振，18 h后开始出现死亡，48 h后全部死亡；而对照组小白鼠健康活泼。剖检死亡的小白鼠可见肝脏肿大瘀血，表面散在针尖大小的出血点，心包膜、腹膜、肺、肾、脾脏均有不同程度的出血。从死亡小白鼠的肝脏、心脏中均可分离到分离菌。综合试验结果可知，分离菌株的培养特性、形态、染色反应均符合大肠杆菌特性，确定为致病性大肠杆菌。
2.4分离菌药物敏感性试验结果
以抑菌圈直径大小作为判定药物敏感性高低的标准，抑菌圈直径越大表明细菌对该药的敏感性越高。抑菌圈直径≥21 mm为高度敏感；在15.1～20.0 mm范围内为中度敏感；≤14 mm 为低敏或耐药。抑菌圈直径的测定结果见表2。研究表明，虽然常德地区3个不同养鸡场的大肠杆菌菌株对30种药物的敏感性存在一定差异，但是同一养鸡场的大肠杆菌菌株对抗生素的敏感性几乎一致。
养殖户把药物防治作为控制大肠杆菌的主要手段，但药敏试验普及率很低，用药盲目性非常大，且在实际生产中有时用药不合理，如低剂量长时间使用，随意加大剂量或根据个人经验感觉盲目添加等，均会造成大肠杆菌严重耐药，从而导致药效下降甚至无效，药物控制难度增大，耐药菌株增多。75 株受试大肠杆菌均对除头孢曲松外的29种抗菌药物有多重耐药性，表现为对4种或4种以上药物耐药，8耐菌株所占比例最大，为14.67%；其次是5耐、9耐，分别占10.67%、9.33%。因此在临床用药方面或作为饲料添加药物时，有条件的应该进行药敏试验，尽量选择高效敏感的药物，尽量避免长期大量使用同一种药物，也可以几种药物交替使用，要足量、按疗程给药，以免产生耐药性。
参考文献：
[1]刘观忠，赵超，董修建.“痢得停”对蛋用雏鸡大肠杆菌病的治疗效果及作用机理研究[J]. 黑龙江畜牧兽医，2012（11）：145-147.
[2]Wayne P A. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[M]. Pennsylvania：NCCLS，2001：1-23.
[3]李刚，文英，铁生虎，等. 规模化猪场仔猪致病性大肠埃希菌的耐药性检测[J]. 动物医学进展，2010，31（8）：117-121.
[4]Khan A，Das S C，Ramamurthy T，et al. Antibiotic resistance，virulence gene，and molecular profiles of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from diverse sources in Calcutta，India[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（6）：2009-2015.
关键词：鸡；致病性大肠杆菌；耐药性
中图分类号： S852.61+2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0226-03
收稿日期：2013-10-10
基金项目：湖南省“十二五”重点建设学科（动物学）项目（编号：湘教发[2011]76 号）；湖南省高校科技创新团队项目（编号：2008244）；湖南省动物学重点实验室项目（编号：200824632）；湖南文理学院青年专项基金（编号：QNYX0811）。
作者简介：李娜（1977—），女，吉林长春人，硕士，讲师，研究方向为预防兽医学。E-mail：vetlina@163.com。大肠杆菌为临床上常见的病原菌，在腹泻畜禽的粪便中及各种原因引起的败血症畜禽中都能分离到致病性大肠杆菌。该病的主要特征包括心包炎、肝周炎、脐炎、气囊炎、败血症、眼炎、滑膜炎、卵黄性腹膜炎等，多继发新城疫、传染性喉气管炎等疾病，导致鸡群高死亡率，对养鸡生产的危害极大[1]。国内已有很多关于鸡大肠杆菌病流行病学的研究报道，主要针对我国的主要省（市），而对较小的市、县的研究报道并不多。由于大肠杆菌血清型多、抗原复杂，在小区域间也存在较大差异；同时随着抗生素的广泛应用，大肠杆菌的耐药性越来越强。为了能准确防治鸡大肠杆菌病，应在尽可能小的区域内对其进行病原血清型调查，并合理用药。目前，国内尚无对湖南省常德地区鸡场大肠杆菌耐药性监测的调查研究报道。为此，笔者从2006年10月至2012年12月对湖南省常德地区范围内的鸡大肠杆菌病流行情况和耐药情况进行了调查和监测，以了解湖南省常德地区的主要流行菌株的耐药规律，为兽医临床用药提供指导性参考意见。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1病料采集在2006年10月至2012年12月期间，选取105份湖南省常德地区饲养的疑似大肠杆菌病鸡的脏器。
1.1.2培养基及试剂普通琼脂平板培养基、三糖铁（TSI）琼脂培养基、伊红美兰（EMB）琼脂培养基、麦康凯（MAC）琼脂培养基，购自北京奥博星生物技术责任有限公司；生化试验微量发酵管，购自杭州微生物试剂有限公司；普通营养肉汤，自制。
1.1.3试验动物18～25 g/只的小白鼠，购自湖南农业大学小动物室。
1.1.4药敏纸片试验用药敏纸片共30种，包括阿莫西林、哌拉西林、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氨苄青霉素、苯唑青霉素、妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素、头孢哌酮、头孢他啶、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松、头孢氨苄、四环素、氯霉素、红霉素、新霉素、壮观霉素、强力霉素、林可霉素、乙酰螺旋霉素、氯洁霉素、呋喃妥因、氨曲南、复方新诺明、利福平等，购于杭州天和微生物试剂有限公司。
1.2试验方法
1.2.1细菌形态与分离培养将采集的新鲜病料分别划线接种于普通培养基、MAC、EMB培养基上，同时分别穿刺TSI琼脂管，置于37 ℃恒温箱培养18～24 h后观察；挑取疑似的单个菌落进行革兰氏染色镜检，将培养特性及形态、染色反应、排列均符合大肠杆菌特征的菌株划线接种于普通营养琼脂平板上进行细菌的数次纯化，然后将纯化的细菌接种于普通斜面培养基上，4 ℃保存备用。
1.2.2生化特性鉴定将分离的60个致病菌株接种于普通肉汤中，37 ℃恒温箱培养24～48 h后适量接种于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、尿素、H2S、靛基质、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、MR、VP微量发酵管中，置于37 ℃恒温箱培养24 h后观察生化反应结果。靛基质发酵管中滴加1滴靛基质试剂、MR发酵管中滴加1滴MR试剂即可观察结果；VP发酵管中滴加2滴VP甲液、1滴VP乙液，置于37 ℃培养2 h即可观察结果。
1.2.3大肠杆菌致病性试验取已鉴定的、生化反应符合大肠杆菌的各个菌株于37 ℃恒温箱培养18 h的普通肉汤培养物（菌液浓度为3.0×109 CFU/mL），经纯粹检验合格后分别腹腔接种18～25 g小白鼠，按0.2 mL/只的剂量接种，每个菌株接种6只；对照组按相同的途径接种0.2 mL普通肉汤培养液，共接种6只。接种后饲养观察120 h小白鼠的存活情况，记录小白鼠的死亡时间并对死亡小白鼠进行剖检取肝脏、心脏，用EMB平板进行接种菌回收试验以分离致病菌。
1.2.4分离菌药物敏感性试验采用WHO推荐的 Kriby-Bauer （K-B）法[2]对分离鉴定的75株大肠杆菌进行耐药性监测，判断标准参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁布的M100-S15药敏试验纸片扩散法法规[2]和相关文献[3-4]，以高敏、中敏、低敏或耐药3种形式对抑菌圈大小作出判定。先将菌株接种到普通营养琼脂斜面培养基上，37 ℃ 恒温箱培养18 h，用生理盐水洗下菌苔；将菌悬液稀释到麦氏比浊管中，相当于终浓度5×107～1×108 CFU/mL；将普通营养琼脂倾注于直径为10 cm的平皿上，制成厚4 mm的营养琼脂平板，15 min内用灭菌棉拭子蘸取上述浓度的菌悬液，在管内壁挤去多余菌液后在琼脂平板表面涂布接种3次，每次旋转70°，最后沿平板内缘涂抹1周；室温干燥3～5 min后，用无菌镊子将药敏纸片紧贴于营养琼脂平板表面，各纸片中心的距离应大于24 mm，纸片距平板内缘的距离应大于 15 mm；37 ℃恒温箱培养16～18 h后观察结果，记录各纸片的抑菌圈直径。 2结果与分析
2.1细菌形态及生长情况
由细菌培养结果可知，在普通營养琼脂平板上的菌落生长良好、湿润，呈现半透明状态与灰白色，边缘光滑；在EMB琼脂培养基平板上的细菌形成中等大小、边缘整齐、表面光滑、黑紫色带金属光泽的菌落；在MAC琼脂培养基平板上的细菌长出圆形粉红色、表面光滑圆形中等大小的菌落；TSI管底及斜面培养的细菌均变黄色，产气而不产硫化氢；经过革兰氏染色镜检后，镜下均可见大量散在的红色、中等大小、两端钝圆的无芽孢G-短小直杆菌。
2.2分离菌的生化特性
分别对分离出的60株致病细菌进行生化试验，结果均符合大肠杆菌的生化特性，详见表1。
2.3大肠杆菌致病性试验
小白鼠在接种分离菌12 h后，均表现出精神不振，18 h后开始出现死亡，48 h后全部死亡；而对照组小白鼠健康活泼。剖检死亡的小白鼠可见肝脏肿大瘀血，表面散在针尖大小的出血点，心包膜、腹膜、肺、肾、脾脏均有不同程度的出血。从死亡小白鼠的肝脏、心脏中均可分离到分离菌。综合试验结果可知，分离菌株的培养特性、形态、染色反应均符合大肠杆菌特性，确定为致病性大肠杆菌。
2.4分离菌药物敏感性试验结果
以抑菌圈直径大小作为判定药物敏感性高低的标准，抑菌圈直径越大表明细菌对该药的敏感性越高。抑菌圈直径≥21 mm为高度敏感；在15.1～20.0 mm范围内为中度敏感；≤14 mm 为低敏或耐药。抑菌圈直径的测定结果见表2。研究表明，虽然常德地区3个不同养鸡场的大肠杆菌菌株对30种药物的敏感性存在一定差异，但是同一养鸡场的大肠杆菌菌株对抗生素的敏感性几乎一致。
养殖户把药物防治作为控制大肠杆菌的主要手段，但药敏试验普及率很低，用药盲目性非常大，且在实际生产中有时用药不合理，如低剂量长时间使用，随意加大剂量或根据个人经验感觉盲目添加等，均会造成大肠杆菌严重耐药，从而导致药效下降甚至无效，药物控制难度增大，耐药菌株增多。75 株受试大肠杆菌均对除头孢曲松外的29种抗菌药物有多重耐药性，表现为对4种或4种以上药物耐药，8耐菌株所占比例最大，为14.67%；其次是5耐、9耐，分别占10.67%、9.33%。因此在临床用药方面或作为饲料添加药物时，有条件的应该进行药敏试验，尽量选择高效敏感的药物，尽量避免长期大量使用同一种药物，也可以几种药物交替使用，要足量、按疗程给药，以免产生耐药性。
参考文献：
[1]刘观忠，赵超，董修建.“痢得停”对蛋用雏鸡大肠杆菌病的治疗效果及作用机理研究[J]. 黑龙江畜牧兽医，2012（11）：145-147.
[2]Wayne P A. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[M]. Pennsylvania：NCCLS，2001：1-23.
[3]李刚，文英，铁生虎，等. 规模化猪场仔猪致病性大肠埃希菌的耐药性检测[J]. 动物医学进展，2010，31（8）：117-121.
[4]Khan A，Das S C，Ramamurthy T，et al. Antibiotic resistance，virulence gene，and molecular profiles of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from diverse sources in Calcutta，India[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（6）：2009-2015.