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摘要：以NPT Ⅱ基因为筛选标记，利用农杆菌转化系统将目的基因ZmHSD1转入玉米自交系昌7-2、齐319和18-599的胚性愈伤组织，筛选抗性愈伤，并获得再生植株。对再生植株基因组DNA进行PCR检测表明，ZmHSD1基因已经整合到玉米基因组中，并最终获得转基因T1代种子。
关键词：玉米；农杆菌；胚性愈伤组织；ZmHSD1基因
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）07-0006-03
糖皮质激素是一类动物激素，参与糖、脂肪和蛋白质的生物合成和代谢等过程，还具有抗炎的作用[1]。11β-羟基类固醇脱氢酶（11β-hydroxysteroid dehydrogenase， 11β-HSD）是调节糖皮质激素的关键酶，它促进活性糖皮质激素与非活性激素之间的相互转换[2，3]。虽然目前在植物中还没有鉴定出11β-HSD，但是随着拟南芥基因组测序工作的完成，发现了八个类似HSD的基因。最先鉴定出的是一种油菜籽HSD，它在利用ABA类似物抑制种子萌发的过程中过量表达[4]；Jolivet等[5]证实在芝麻和油料作物中只存在微量的HSD，这些HSD编码的蛋白表现出与NADP+所依赖的11β-HSD、17β-HSD/17β-类固醇脱氢酶相同的性能[6]。AtHSD1基因包括6个外显子和5个内含子，它编码的蛋白由389个氨基酸组成，李凤玲等[7]将AtHSD1的cDNA连接到35S启动子后整合到拟南芥中，发现转基因植株明显比野生株粗壮，其分支和长角果的数量也明显增多，转AtHSD1基因植株的表型与过量产生BR或过量表达BR受体基因BRI1的表型一致[8～10]；同时发现转基因植株的抗盐性比野生植株高[7]。因此，该基因在改善农作物植株生长、提高产量方面有很大的潜力。
本研究利用农杆菌介导的遗传转化方法，尝试将ZmHSD1基因转入玉米自交系品种，以期获得转基因玉米植株，拓宽玉米种质的遗传背景，为高产稳产玉米品种的选育服务。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1植物材料玉米（Zea mays L.）自交系18-599、齐319和昌7-2。
1.1.2目的基因、载体、菌株ZmHSD1表达载体由山东农业大学生命科学学院基因工程实验室构建。表达载体中，目的基因为ZmHSD1，其启动子为Ubi；筛选标记基因为NPTⅡ，其启动子为CaMV35S（图1）。本研究所用质粒为PZP211，大肠杆菌菌株为DH5α，农杆菌菌株为LBA4404。
1.2试验方法
1.2.1培养基在N6改良培养基[11]的基础上，添加0.25 mg/L Na2MnO3、0.025 mg/L CuSO4·5H2O和0.025 mg/L CoCl2·6H2O。
1.2.2幼胚愈伤组织受体系统参照孙庆泉等[11]的方法，取幼胚接种于诱导培养基上，24～25℃暗培养，继代，选择诱Ⅱ型愈伤组织为转化受体。
1.2.3农杆菌介导的遗传转化
①农杆菌的培养与活化：将低温保存的农杆菌菌种LBA4404接种到添加25 mg/L Spe的YEB固体培养基平板上，挑取单菌落接种于含25 mg/L Spe的 YEB液体培养基中，置于摇床上预活化（28℃，200 r/min），取预活化的菌液培养至对数生长期备用。
②愈伤组织浸染：浸染前将新培养的菌液离心沉淀菌体，用液体N6培养基重悬，并稀释到所需OD值。将Ⅱ型愈伤组织分离成米粒大小的小块，投放到稀释好的菌液中浸染。用灭菌的滤纸吸干愈伤表面的菌液，并将其摆放到共培养培养基上暗培养3 d，用头孢水洗菌。将洗好的愈伤放到恢复培养基上恢复培养。
③抗性愈伤的筛选、分化和再生：恢复培养后的愈伤组织依次转移到1次、2次、3次筛选培养基上，进行抗性筛选，筛选剂为巴龙霉素。将筛选后存活的愈伤转到分化培养基上分化成苗。分化苗苗高4～5 cm时转到生根壮苗培养基上。当苗适度生根后转到基质（基质∶蛭石=1∶1）中。成活植株转到大田隔离区。
1.2.4转基因植株的PCR检测CTAB法提取基因组DNA。对转化植株、阳性对照（质粒）和阴性对照（未转化植株）进行PCR检测，检测对象为目的基因ZmHSD1和标记基因NPTⅡ。根据已知的ZmHSD1基因序列，利用primer premier 5.0软件设计ZmHSD1的引物，上游引物在启动子内部，下游引物在编码区内，S： CACGATTCTTCCTCGGCTCCTCT， A： TGCTACTCCTTCCTTTCCTGGCT；标记基因NPTⅡ的引物为S： GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG，A： AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC。引物由上海生工生物工程公司合成。用25 μl PCR反应体系。扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，59℃退火50 s，72℃延伸50 s，35 个循环；72℃终延伸10 min；4℃保存。1%琼脂糖凝胶、1%TBE电泳缓冲液电泳，溴化乙锭染色，紫外分析，拍照。
2结果与分析
2.1转基因植株的获得
将玉米幼胚（授粉后10～15 d）接种于诱导培养基上，诱导出胚性愈伤组织（图2-1，2-2，2-3）；将经农杆菌浸染后的愈伤（图2-4），恢复培养1周，愈伤组织生长状态有所改善，转入筛选培养基筛选，1轮后有些愈伤开始变褐，3轮后大部分未转化愈伤褐化死亡，愈伤组织上出现的小块鲜活愈伤组织突起基本上为抗性愈伤，抗性愈伤在筛选培养基上生长正常 （图2-5）；将经过3轮筛选的愈伤转到分化培养基上光照培养，25 d后愈伤表面开始出现绿色芽点，之后绿色芽点逐渐分化成巴龙抗性苗（图2-6）；将幼苗转到生根壮苗培养基上（图2-7），使苗生根，期间有少量白化苗出现；待苗长出2～3条根、高约10～15 cm时，打开封口膜，炼苗5 d后移栽花盆 （图2-8）；3周后移栽转基因隔离区，开花期进行人工自交结实（图2-9）；最终获得转基因种子（图2-10）。 2.2转基因植株分子检测
2.2.1目的基因ZmHSD1的PCR检测利用ZmHSD1引物对抗性苗基因组DNA进行PCR检测，有33株抗性苗出现与阳性对照一致的444 bp的特异性扩增条带（图3），表明该33株转基因植株已将外源基因整合到基因组中。
2.2.2标记基因NPT Ⅱ的PCR检测对已知阳性转基因植株的基因组DNA进行标记基因NPT Ⅱ的PCR扩增，均得到与阳性对照一致的650 bp的特异性扩增条带（图4），表明目的基因PCR检测的阳性株也全为标记基因阳性株。对标记基因的检测可以排除玉米基因组中ZmHSD1基因的干扰。
3结论
3个供试玉米自交系18-599、齐319和昌7-2的幼胚都能诱导产生Ⅱ型愈伤组织，其中18-599所获愈伤组织质量好、数量多，适于大量转化；齐319和昌7-2愈伤颗粒松散、质量不高，尤其是昌7-2，胚性愈伤数量较少。
经农杆菌转化共得到899株转化株，通过PCR检测初步证明有33株为阳性转化植株，其中18-599有686株转化株，阳性株21株，转化效率为3.06%；齐319有183株转化株，阳性株10株，转化率为5.46%；昌7-2有30株转化株，阳性株2株，转化率为6.67%。
最终获得ZmHSD1转基因玉米T1代种子，为玉米优良品种的选育奠定了基础。
参考文献：
[1]Tomlinson J W， Walker E A， Bujalska I J， et al. 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1： a tissue-specific regulator of glucocorticoid response [J]. Endocrine Reviews， 2004， 25（5）： 831-866.
[2]Kallberg Y， Opperman U， Jornvall H， et al. Short-chain dehydrogenase/reductase （SDR） relationships： a large family with eight clusters common to human， animal， and plant genomes [J]. Protein Science， 2002， 11（3）： 636-641.
[3]McCormick K L， Wang X D， Mick G J. Evidence that the 11β-hydroxysteroid dehydrogenase （11 β-HSD1） is regulated by pentose pathway flux： studies in rat adipocytes and microsomes [J].Journal of Biological Chemistry， 2006， 281（1）： 341-347.
[4]Li F， Wu X Z， Tsang E， et al. Transcriptional profiling of imbibed Brassica napus seed [J]. Genomics， 2005， 86（6）： 718-730.
[5]Jolivet P， Roux E， d’Andrea S， et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS [J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2004， 42（6）：501-509.
[6]d’Andrea S， Canonge M， Beopoulos A， et al. At5g50600 encodes a member of the short-chain dehydrogenase reductase superfamily with 11β- and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase activities associated with Arabidopsis thaliana seed oil bodies[J]. Biochimie， 2007， 89（2）：222-229.
[7]Li F L， Asami T， Wu X Z， et al. A putative hydroxysteroid dehydrogenase involved in regulating plant growth and development [J]. Plant Physiology， 2007， 145（1）：87-97.
[8]Friedrichsen D M， Joazeiro C A， Li J， et al. Brassinosteroid-insensitive-1 is a ubiquitously expressed leucine-rich repeat receptor serine/threonine kinase[J]. Plant Physiology， 2000， 123（4）：1247-1256.
[9]Wang Z Y， Seto H， Fujioka S， et al. BRI1 is a critical component of a plasma-membrane receptor for plant steroids[J]. Nature， 2001， 410（6826）： 380-383.
[10]关钰， 王海娇， 王学路.BKI1通过其22个氨基酸区域与BRI1的互作来调控油菜素甾醇信号[J]. 复旦学报（自然科学版）， 2011， 50（3）：320-327.
[11]孙庆泉， 张颖， 荣廷昭， 等.玉米自交系18-599（白）转化受体体系的建立和转barnase基因植株的获得[J]. 作物学报， 2007， 33（5）：738-743.
关键词：玉米；农杆菌；胚性愈伤组织；ZmHSD1基因
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）07-0006-03
糖皮质激素是一类动物激素，参与糖、脂肪和蛋白质的生物合成和代谢等过程，还具有抗炎的作用[1]。11β-羟基类固醇脱氢酶（11β-hydroxysteroid dehydrogenase， 11β-HSD）是调节糖皮质激素的关键酶，它促进活性糖皮质激素与非活性激素之间的相互转换[2，3]。虽然目前在植物中还没有鉴定出11β-HSD，但是随着拟南芥基因组测序工作的完成，发现了八个类似HSD的基因。最先鉴定出的是一种油菜籽HSD，它在利用ABA类似物抑制种子萌发的过程中过量表达[4]；Jolivet等[5]证实在芝麻和油料作物中只存在微量的HSD，这些HSD编码的蛋白表现出与NADP+所依赖的11β-HSD、17β-HSD/17β-类固醇脱氢酶相同的性能[6]。AtHSD1基因包括6个外显子和5个内含子，它编码的蛋白由389个氨基酸组成，李凤玲等[7]将AtHSD1的cDNA连接到35S启动子后整合到拟南芥中，发现转基因植株明显比野生株粗壮，其分支和长角果的数量也明显增多，转AtHSD1基因植株的表型与过量产生BR或过量表达BR受体基因BRI1的表型一致[8～10]；同时发现转基因植株的抗盐性比野生植株高[7]。因此，该基因在改善农作物植株生长、提高产量方面有很大的潜力。
本研究利用农杆菌介导的遗传转化方法，尝试将ZmHSD1基因转入玉米自交系品种，以期获得转基因玉米植株，拓宽玉米种质的遗传背景，为高产稳产玉米品种的选育服务。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1植物材料玉米（Zea mays L.）自交系18-599、齐319和昌7-2。
1.1.2目的基因、载体、菌株ZmHSD1表达载体由山东农业大学生命科学学院基因工程实验室构建。表达载体中，目的基因为ZmHSD1，其启动子为Ubi；筛选标记基因为NPTⅡ，其启动子为CaMV35S（图1）。本研究所用质粒为PZP211，大肠杆菌菌株为DH5α，农杆菌菌株为LBA4404。
1.2试验方法
1.2.1培养基在N6改良培养基[11]的基础上，添加0.25 mg/L Na2MnO3、0.025 mg/L CuSO4·5H2O和0.025 mg/L CoCl2·6H2O。
1.2.2幼胚愈伤组织受体系统参照孙庆泉等[11]的方法，取幼胚接种于诱导培养基上，24～25℃暗培养，继代，选择诱Ⅱ型愈伤组织为转化受体。
1.2.3农杆菌介导的遗传转化
①农杆菌的培养与活化：将低温保存的农杆菌菌种LBA4404接种到添加25 mg/L Spe的YEB固体培养基平板上，挑取单菌落接种于含25 mg/L Spe的 YEB液体培养基中，置于摇床上预活化（28℃，200 r/min），取预活化的菌液培养至对数生长期备用。
②愈伤组织浸染：浸染前将新培养的菌液离心沉淀菌体，用液体N6培养基重悬，并稀释到所需OD值。将Ⅱ型愈伤组织分离成米粒大小的小块，投放到稀释好的菌液中浸染。用灭菌的滤纸吸干愈伤表面的菌液，并将其摆放到共培养培养基上暗培养3 d，用头孢水洗菌。将洗好的愈伤放到恢复培养基上恢复培养。
③抗性愈伤的筛选、分化和再生：恢复培养后的愈伤组织依次转移到1次、2次、3次筛选培养基上，进行抗性筛选，筛选剂为巴龙霉素。将筛选后存活的愈伤转到分化培养基上分化成苗。分化苗苗高4～5 cm时转到生根壮苗培养基上。当苗适度生根后转到基质（基质∶蛭石=1∶1）中。成活植株转到大田隔离区。
1.2.4转基因植株的PCR检测CTAB法提取基因组DNA。对转化植株、阳性对照（质粒）和阴性对照（未转化植株）进行PCR检测，检测对象为目的基因ZmHSD1和标记基因NPTⅡ。根据已知的ZmHSD1基因序列，利用primer premier 5.0软件设计ZmHSD1的引物，上游引物在启动子内部，下游引物在编码区内，S： CACGATTCTTCCTCGGCTCCTCT， A： TGCTACTCCTTCCTTTCCTGGCT；标记基因NPTⅡ的引物为S： GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG，A： AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC。引物由上海生工生物工程公司合成。用25 μl PCR反应体系。扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，59℃退火50 s，72℃延伸50 s，35 个循环；72℃终延伸10 min；4℃保存。1%琼脂糖凝胶、1%TBE电泳缓冲液电泳，溴化乙锭染色，紫外分析，拍照。
2结果与分析
2.1转基因植株的获得
将玉米幼胚（授粉后10～15 d）接种于诱导培养基上，诱导出胚性愈伤组织（图2-1，2-2，2-3）；将经农杆菌浸染后的愈伤（图2-4），恢复培养1周，愈伤组织生长状态有所改善，转入筛选培养基筛选，1轮后有些愈伤开始变褐，3轮后大部分未转化愈伤褐化死亡，愈伤组织上出现的小块鲜活愈伤组织突起基本上为抗性愈伤，抗性愈伤在筛选培养基上生长正常 （图2-5）；将经过3轮筛选的愈伤转到分化培养基上光照培养，25 d后愈伤表面开始出现绿色芽点，之后绿色芽点逐渐分化成巴龙抗性苗（图2-6）；将幼苗转到生根壮苗培养基上（图2-7），使苗生根，期间有少量白化苗出现；待苗长出2～3条根、高约10～15 cm时，打开封口膜，炼苗5 d后移栽花盆 （图2-8）；3周后移栽转基因隔离区，开花期进行人工自交结实（图2-9）；最终获得转基因种子（图2-10）。 2.2转基因植株分子检测
2.2.1目的基因ZmHSD1的PCR检测利用ZmHSD1引物对抗性苗基因组DNA进行PCR检测，有33株抗性苗出现与阳性对照一致的444 bp的特异性扩增条带（图3），表明该33株转基因植株已将外源基因整合到基因组中。
2.2.2标记基因NPT Ⅱ的PCR检测对已知阳性转基因植株的基因组DNA进行标记基因NPT Ⅱ的PCR扩增，均得到与阳性对照一致的650 bp的特异性扩增条带（图4），表明目的基因PCR检测的阳性株也全为标记基因阳性株。对标记基因的检测可以排除玉米基因组中ZmHSD1基因的干扰。
3结论
3个供试玉米自交系18-599、齐319和昌7-2的幼胚都能诱导产生Ⅱ型愈伤组织，其中18-599所获愈伤组织质量好、数量多，适于大量转化；齐319和昌7-2愈伤颗粒松散、质量不高，尤其是昌7-2，胚性愈伤数量较少。
经农杆菌转化共得到899株转化株，通过PCR检测初步证明有33株为阳性转化植株，其中18-599有686株转化株，阳性株21株，转化效率为3.06%；齐319有183株转化株，阳性株10株，转化率为5.46%；昌7-2有30株转化株，阳性株2株，转化率为6.67%。
最终获得ZmHSD1转基因玉米T1代种子，为玉米优良品种的选育奠定了基础。
参考文献：
[1]Tomlinson J W， Walker E A， Bujalska I J， et al. 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1： a tissue-specific regulator of glucocorticoid response [J]. Endocrine Reviews， 2004， 25（5）： 831-866.
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[3]McCormick K L， Wang X D， Mick G J. Evidence that the 11β-hydroxysteroid dehydrogenase （11 β-HSD1） is regulated by pentose pathway flux： studies in rat adipocytes and microsomes [J].Journal of Biological Chemistry， 2006， 281（1）： 341-347.
[4]Li F， Wu X Z， Tsang E， et al. Transcriptional profiling of imbibed Brassica napus seed [J]. Genomics， 2005， 86（6）： 718-730.
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[6]d’Andrea S， Canonge M， Beopoulos A， et al. At5g50600 encodes a member of the short-chain dehydrogenase reductase superfamily with 11β- and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase activities associated with Arabidopsis thaliana seed oil bodies[J]. Biochimie， 2007， 89（2）：222-229.
[7]Li F L， Asami T， Wu X Z， et al. A putative hydroxysteroid dehydrogenase involved in regulating plant growth and development [J]. Plant Physiology， 2007， 145（1）：87-97.
[8]Friedrichsen D M， Joazeiro C A， Li J， et al. Brassinosteroid-insensitive-1 is a ubiquitously expressed leucine-rich repeat receptor serine/threonine kinase[J]. Plant Physiology， 2000， 123（4）：1247-1256.
[9]Wang Z Y， Seto H， Fujioka S， et al. BRI1 is a critical component of a plasma-membrane receptor for plant steroids[J]. Nature， 2001， 410（6826）： 380-383.
[10]关钰， 王海娇， 王学路.BKI1通过其22个氨基酸区域与BRI1的互作来调控油菜素甾醇信号[J]. 复旦学报（自然科学版）， 2011， 50（3）：320-327.
[11]孙庆泉， 张颖， 荣廷昭， 等.玉米自交系18-599（白）转化受体体系的建立和转barnase基因植株的获得[J]. 作物学报， 2007， 33（5）：738-743.