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[摘要]目的：初步评价牙科全瓷材料3Y-TZP生物相容性。方法：根据ISO标准采用体外细胞毒实验（MTT法）测试不同浓度和浸提时间的材料浸提液L-929小鼠结缔组织成纤维细胞的影响从而对全瓷材料3Y-TZP的生物相容性进行初筛。结果：各浓度组OD值均与阴性对照无显著性差异（P>0.05），与阳性组差异显著 (P<0.01)，材料毒性级别0级。结论：两种材料体外细胞毒实验阴性，初步认为材料具有较好的生物相容性。
[关键词]3Y-TZP；生物相容性；体外细胞毒实验
[中图分类号]R783[文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2008）03-03
Preliminary evaluation on biocompatibility ofall-ceramic dental material:3Y-TZP
LI Guo-hua1,GONG Zhen-yu1,YU Shu-xiang2,CHEN Ji-hua3
(1.Department of Stomatology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou 350025,Fujian,China)
Abstract: Objective To preliminarily evaluate the biocompatibility of 3Y-TZP which were used as a new dental all-ceramic materials. Methods According to ISO standards, in vitro cytotoxicity-test (MTT method) on L-929 cell were carried on. Results The OD-value of each test group were similar to the negative control and significantly different from positive control which indicated that the materials tested were safe to L-929 cells. Conclusion It is preliminarily estimated that 3Y-TZP is a safe material for dental clinical application.
Key words：3Y-TZP;biocompatibility;vitro cytotoxicity-test(MTT method)
随着人们对审美要求的不断提高，越来越多的修复专业人士及患者乐于接受色泽逼真，无龈缘灰线的全瓷修复体。以往的全瓷材料因脆性大使其临床应用尤其是后牙桥、多单位长桥受到限制，氧化锆具有应力诱发相变增韧性能而被称为韧性陶瓷，是最有希望替代金属烤瓷的全瓷材料[1-2]。目前国内外的此类产品研究方兴未艾。良好的生物相容性是生物材料包含牙科材料得以应用的重要前提，也是保证临床安全的重要技术指标。因此针对这种材料的生物学评价是十分必要和重要的。本研究采用体外细胞毒性试验的方法检测该材料对细胞生长状况的影响，从而初步评价其生物相容性。
1材料和方法
1.1实验材料：3mol%氧化钇稳定的四方多晶氧化锆（3Y-TZP）全瓷材料试件；受试细胞株：小鼠结缔组织成纤维细胞（L-929细胞），ISO推荐；主要试剂与设备：①MTT：全称为3-（4，5-二甲基噻唑基-2）-2，5二苯基四氮唑溴盐（Sigma，USA）；实验前用PBS（0.01mol/L，pH值7.4）新鲜配制，0.22μm微孔滤菌器过滤除菌；②DMSO（西安化学试剂厂）：全称为二甲基亚砜；③DMEM培养液，10%小牛血清；④BioRAD Model-550酶联免疫酶标仪；⑤Heraus二氧化碳孵箱；⑥Olympus IX-70倒置相差显微镜。
1.2实验方法
1.2.1陶瓷材料浸渍液的制备：将实验材料所作试件打磨圆钝后，无水乙醇超声清洗20min，干燥后在121℃，33MPa压力下灭菌处理后放入无菌培养皿，加入10mlDMEM培养液（表面积与浸提液之比为1.5cm2/ml）后置于37℃培养箱中浸泡24h，制成浸提液。完成后用DMEM培养液分别稀释，制备100%、50%、25%、12.5%的浸提液，放入4℃冰箱保存。
1.2.2冻存L-929细胞复苏后经过两次传代，生长情况稳定。取对数生长期的受试细胞系，胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度约1 000个/ml，接种细胞于96孔培养板（200μl/孔，n=4）置于5%CO2、37℃培养箱中，在饱和湿度条件下培养24h。
1.2.3准备4块96孔培养板，分别用于连续培养1、2、4、8天组。每块培养板按照阴性对照，4个不同浓度的实验组，阳性对照，空白对照组（调零）划区分组，每组样本5孔。
1.2.4观察细胞贴壁良好后，弃去原培养液，按照实验分组分别将当日要用的不同浓度的材料浸提液按10%的浓度加入小牛血清，后加入各实验组（200μl/孔），阴性对照为DMEM培养液，加入血清的培养液，单纯浸提液。阳性对照为0.1%苯酚，常规培养。
1.2.5 MTT检测：分别培养1、2、4、8天（其中4天与8天组需要隔3天换液一次），终止培养前4h加入0.5%MTT（20μl/孔），继续培养4h，加入DMSO150μl置于室温下15～20min，震荡培养板10min使染色均匀，采用酶联检测仪在490nm波长测定各孔光吸收值（OD值），计算出各组的均值。
1.2.6采用倒置相差显微镜，观察细胞形态，于MTT检测前对细胞照相。
1.2.7评价方法：计算出每种材料的阴性对照和各浓度组的OD均值（n=4）。以阴性对照的OD值作为100%细胞增殖率，则各浓度组的细胞增殖百分率可依式P%=各浓度组OD均值/阴性对照组OD均值×100%求出，将浸提液各浓度组的P%转化为0～5级细胞毒性：
2结果（见表1～4，图1～4）
培养同样的培养时间各浓度实验组的OD值之间没有明显的差异（P＞0.05）；随培养时间延长，各浓度组OD值都逐渐增高，不同浓度的各实验组与阴性对照组之间无显著性差异（P＞0.05）；各实验组均与阳性对照组有显著差异（P＜0.01）。可以认为实验材料细胞毒性分级与阴性对照同为0级，阳性对照毒级为5级。根据细胞增殖曲线可见：各浓度实验组的细胞增殖曲线都与阴性对照组走势相似，与阳性对照组差别明显。
图2～4分别为MTT检测前阴性对照组8天、100％浓度的实验组培养8天及阳性对照组培养1天细胞的照片。可见实验组细胞形态良好，为长梭形和多角形，并可见圆形分裂细胞，表明细胞生长旺盛，细胞折光性强，与阴性对照组相似。阳性对照组正常细胞形态消失，核固缩或溶解，漂浮在培养液中。染色后，实验组MTT结晶物密度与阴性对照组相似，呈现为透明的蓝紫色，阳性组染色后变色不明显。
3讨论
为了检测牙科材料的生物相容性，细胞毒性实验常常是材料初选时的必测项目[3]。本实验采用间接接触方法，通过细胞的增殖率来测定细胞的生长增殖情况，从而间接检测材料对细胞的毒性作用。在正常培养基中，L-929细胞通过有丝分裂呈指数增长，当有外来因素影响其生长时，则会出现细胞粘附力、细胞生物合成活性及细胞增殖率的下降，严重时可导致细胞死亡[4]。本实验基于此原理，通过材料对细胞增殖率的影响大小，来判定材料的体外细胞毒性程度。
MTT法的原理是生活细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶可与外源性的MTT发生氧化还原反应，被还原成不溶于水的蓝紫色结晶物沉积于细胞内，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，然后酶联免疫检测仪在490nm波长处测定光吸收值，就可以间接反应活细胞的数量[5]。目前国际上在评价一种细胞毒性实验方法时，往往把该方法的生物学终点和其证实过程放在首位，即看该方法最终测定的是细胞哪个方面的生物学变化。如观察细胞的形态学变化，细胞核计数及测定细胞的酶活性改变等。MTT试验法的生物学终点是重要的细胞器-线粒体，线粒体在细胞的生命活动中是一个能量供应站，其数目在细胞生命活动旺盛时增多，衰退时则减少。线粒体病变被认为是表示细胞受损伤最灵敏的指征。MTT试验法用线粒体作为其生物学终点，可以十分灵敏地反映出被测试材料对细胞造成的毒性损害程度。
MTT试验法具有通用性，广泛用于各种器械材料的评价。通常可以根据生活细胞的数量，细胞的形态学观察，死亡分解的细胞数量和弥散范围等方面来衡量，将细胞增殖度法与细胞的形态学观察相结合，可以更加有效地评价材料的细胞毒性。细胞毒性与被测材料的量尤其是表面积有关[6]，本实验为此设计了不同浓度的浸提液比较，其统计结果无显著性差异，也从侧面说明本实验材料对细胞没有毒性。
4结论
从毒性评级比较，本实验所检测的3Y-TZP全瓷材料的毒级为0级，可认为对细胞无毒，即该材料属于惰性材料，不会干扰生物细胞的正常功能，可以初步认为该材料对人体是安全的。
[参考文献]
[1]李国华，陈吉华.粉体粒度对全瓷材料3Y-TZP力学性能与显微结构的影响[J].中国美容医学，2007，16（1）：91-95.
[2]上海生物材料研究测试中心译，国际标准化组织7406技术报告.牙科材料的生物学评价[J].口腔材料器械杂志，1995；4(1)：41-46.
[3]Stanley HR. Biological evaluation of dental materials[J].Int Dent J,1992,42(1):37-46.
[4]Mollnes TE. Biocompatibility: complement as mediator of tissue damage and as indicator of incompatibility[J]. Exp Clin Immunogenet,1997,14(1):24-29.
[5]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods,1983,65(1-2):55-63.
[6]Meryon SD.The influence of surface area on the in vitro cyto－toxicity of a range of dental materials[J].J Biomed Mat Res,1987,21:1179-1186.
[收稿日期]2007-12-17[修回日期]2008-01-31
编辑/何志斌
[关键词]3Y-TZP；生物相容性；体外细胞毒实验
[中图分类号]R783[文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2008）03-03
Preliminary evaluation on biocompatibility ofall-ceramic dental material:3Y-TZP
LI Guo-hua1,GONG Zhen-yu1,YU Shu-xiang2,CHEN Ji-hua3
(1.Department of Stomatology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou 350025,Fujian,China)
Abstract: Objective To preliminarily evaluate the biocompatibility of 3Y-TZP which were used as a new dental all-ceramic materials. Methods According to ISO standards, in vitro cytotoxicity-test (MTT method) on L-929 cell were carried on. Results The OD-value of each test group were similar to the negative control and significantly different from positive control which indicated that the materials tested were safe to L-929 cells. Conclusion It is preliminarily estimated that 3Y-TZP is a safe material for dental clinical application.
Key words：3Y-TZP;biocompatibility;vitro cytotoxicity-test(MTT method)
随着人们对审美要求的不断提高，越来越多的修复专业人士及患者乐于接受色泽逼真，无龈缘灰线的全瓷修复体。以往的全瓷材料因脆性大使其临床应用尤其是后牙桥、多单位长桥受到限制，氧化锆具有应力诱发相变增韧性能而被称为韧性陶瓷，是最有希望替代金属烤瓷的全瓷材料[1-2]。目前国内外的此类产品研究方兴未艾。良好的生物相容性是生物材料包含牙科材料得以应用的重要前提，也是保证临床安全的重要技术指标。因此针对这种材料的生物学评价是十分必要和重要的。本研究采用体外细胞毒性试验的方法检测该材料对细胞生长状况的影响，从而初步评价其生物相容性。
1材料和方法
1.1实验材料：3mol%氧化钇稳定的四方多晶氧化锆（3Y-TZP）全瓷材料试件；受试细胞株：小鼠结缔组织成纤维细胞（L-929细胞），ISO推荐；主要试剂与设备：①MTT：全称为3-（4，5-二甲基噻唑基-2）-2，5二苯基四氮唑溴盐（Sigma，USA）；实验前用PBS（0.01mol/L，pH值7.4）新鲜配制，0.22μm微孔滤菌器过滤除菌；②DMSO（西安化学试剂厂）：全称为二甲基亚砜；③DMEM培养液，10%小牛血清；④BioRAD Model-550酶联免疫酶标仪；⑤Heraus二氧化碳孵箱；⑥Olympus IX-70倒置相差显微镜。
1.2实验方法
1.2.1陶瓷材料浸渍液的制备：将实验材料所作试件打磨圆钝后，无水乙醇超声清洗20min，干燥后在121℃，33MPa压力下灭菌处理后放入无菌培养皿，加入10mlDMEM培养液（表面积与浸提液之比为1.5cm2/ml）后置于37℃培养箱中浸泡24h，制成浸提液。完成后用DMEM培养液分别稀释，制备100%、50%、25%、12.5%的浸提液，放入4℃冰箱保存。
1.2.2冻存L-929细胞复苏后经过两次传代，生长情况稳定。取对数生长期的受试细胞系，胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度约1 000个/ml，接种细胞于96孔培养板（200μl/孔，n=4）置于5%CO2、37℃培养箱中，在饱和湿度条件下培养24h。
1.2.3准备4块96孔培养板，分别用于连续培养1、2、4、8天组。每块培养板按照阴性对照，4个不同浓度的实验组，阳性对照，空白对照组（调零）划区分组，每组样本5孔。
1.2.4观察细胞贴壁良好后，弃去原培养液，按照实验分组分别将当日要用的不同浓度的材料浸提液按10%的浓度加入小牛血清，后加入各实验组（200μl/孔），阴性对照为DMEM培养液，加入血清的培养液，单纯浸提液。阳性对照为0.1%苯酚，常规培养。
1.2.5 MTT检测：分别培养1、2、4、8天（其中4天与8天组需要隔3天换液一次），终止培养前4h加入0.5%MTT（20μl/孔），继续培养4h，加入DMSO150μl置于室温下15～20min，震荡培养板10min使染色均匀，采用酶联检测仪在490nm波长测定各孔光吸收值（OD值），计算出各组的均值。
1.2.6采用倒置相差显微镜，观察细胞形态，于MTT检测前对细胞照相。
1.2.7评价方法：计算出每种材料的阴性对照和各浓度组的OD均值（n=4）。以阴性对照的OD值作为100%细胞增殖率，则各浓度组的细胞增殖百分率可依式P%=各浓度组OD均值/阴性对照组OD均值×100%求出，将浸提液各浓度组的P%转化为0～5级细胞毒性：
2结果（见表1～4，图1～4）
培养同样的培养时间各浓度实验组的OD值之间没有明显的差异（P＞0.05）；随培养时间延长，各浓度组OD值都逐渐增高，不同浓度的各实验组与阴性对照组之间无显著性差异（P＞0.05）；各实验组均与阳性对照组有显著差异（P＜0.01）。可以认为实验材料细胞毒性分级与阴性对照同为0级，阳性对照毒级为5级。根据细胞增殖曲线可见：各浓度实验组的细胞增殖曲线都与阴性对照组走势相似，与阳性对照组差别明显。
图2～4分别为MTT检测前阴性对照组8天、100％浓度的实验组培养8天及阳性对照组培养1天细胞的照片。可见实验组细胞形态良好，为长梭形和多角形，并可见圆形分裂细胞，表明细胞生长旺盛，细胞折光性强，与阴性对照组相似。阳性对照组正常细胞形态消失，核固缩或溶解，漂浮在培养液中。染色后，实验组MTT结晶物密度与阴性对照组相似，呈现为透明的蓝紫色，阳性组染色后变色不明显。
3讨论
为了检测牙科材料的生物相容性，细胞毒性实验常常是材料初选时的必测项目[3]。本实验采用间接接触方法，通过细胞的增殖率来测定细胞的生长增殖情况，从而间接检测材料对细胞的毒性作用。在正常培养基中，L-929细胞通过有丝分裂呈指数增长，当有外来因素影响其生长时，则会出现细胞粘附力、细胞生物合成活性及细胞增殖率的下降，严重时可导致细胞死亡[4]。本实验基于此原理，通过材料对细胞增殖率的影响大小，来判定材料的体外细胞毒性程度。
MTT法的原理是生活细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶可与外源性的MTT发生氧化还原反应，被还原成不溶于水的蓝紫色结晶物沉积于细胞内，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，然后酶联免疫检测仪在490nm波长处测定光吸收值，就可以间接反应活细胞的数量[5]。目前国际上在评价一种细胞毒性实验方法时，往往把该方法的生物学终点和其证实过程放在首位，即看该方法最终测定的是细胞哪个方面的生物学变化。如观察细胞的形态学变化，细胞核计数及测定细胞的酶活性改变等。MTT试验法的生物学终点是重要的细胞器-线粒体，线粒体在细胞的生命活动中是一个能量供应站，其数目在细胞生命活动旺盛时增多，衰退时则减少。线粒体病变被认为是表示细胞受损伤最灵敏的指征。MTT试验法用线粒体作为其生物学终点，可以十分灵敏地反映出被测试材料对细胞造成的毒性损害程度。
MTT试验法具有通用性，广泛用于各种器械材料的评价。通常可以根据生活细胞的数量，细胞的形态学观察，死亡分解的细胞数量和弥散范围等方面来衡量，将细胞增殖度法与细胞的形态学观察相结合，可以更加有效地评价材料的细胞毒性。细胞毒性与被测材料的量尤其是表面积有关[6]，本实验为此设计了不同浓度的浸提液比较，其统计结果无显著性差异，也从侧面说明本实验材料对细胞没有毒性。
4结论
从毒性评级比较，本实验所检测的3Y-TZP全瓷材料的毒级为0级，可认为对细胞无毒，即该材料属于惰性材料，不会干扰生物细胞的正常功能，可以初步认为该材料对人体是安全的。
[参考文献]
[1]李国华，陈吉华.粉体粒度对全瓷材料3Y-TZP力学性能与显微结构的影响[J].中国美容医学，2007，16（1）：91-95.
[2]上海生物材料研究测试中心译，国际标准化组织7406技术报告.牙科材料的生物学评价[J].口腔材料器械杂志，1995；4(1)：41-46.
[3]Stanley HR. Biological evaluation of dental materials[J].Int Dent J,1992,42(1):37-46.
[4]Mollnes TE. Biocompatibility: complement as mediator of tissue damage and as indicator of incompatibility[J]. Exp Clin Immunogenet,1997,14(1):24-29.
[5]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods,1983,65(1-2):55-63.
[6]Meryon SD.The influence of surface area on the in vitro cyto－toxicity of a range of dental materials[J].J Biomed Mat Res,1987,21:1179-1186.
[收稿日期]2007-12-17[修回日期]2008-01-31
编辑/何志斌