【摘 要】
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目的 制备白念珠菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶蛋白Ppt2,用于后期荧光偏振法筛选靶点为Ppt2酶的临床药物.方法 以白念珠菌BWP17基因组DNA为模板,用PCR法扩增PPT2 DNA序列,与线
【机 构】
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上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科,上海200020;上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科,上海,200020;
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目的 制备白念珠菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶蛋白Ppt2,用于后期荧光偏振法筛选靶点为Ppt2酶的临床药物.方法 以白念珠菌BWP17基因组DNA为模板,用PCR法扩增PPT2 DNA序列,与线性化载体pET43.1a(+)通过同源重组连接,成功构建重组表达质粒pET43.1a(+)/PPT2后转化入大肠埃希菌感受态细胞BL21 (DE3),通过IPTG诱导重组蛋白表达,利用超声破碎法抽提蛋白Ppt2后离心收集上清和沉淀,通过SDS-PAGE验证蛋白的可溶性.利用镍柱对蛋白进行纯化,对洗脱馏分透析富集目的蛋白.最后通过Bradford方法测得蛋白含量.结果 在大肠埃希菌BL21中获得了白念珠菌蛋白Ppt2的高效表达;抽提蛋白后SDS-PAGE电泳结果显示Ppt2同时存在可溶性形式和包涵体形式,放大摇菌量后收集上清可溶性蛋白经镍柱纯化得到目的蛋白,再次透析富集蛋白Ppt2后利用Bradford方法测得蛋白Ppt2浓度为0.4 mg/mL.结论 成功制备了白念珠菌的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶蛋白Ppt2,为后期利用荧光偏振法筛选靶点为Ppt2酶的临床药物提供基础.
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