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【摘要】目的：建立柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星的高效液相色谱分析方法。方法：色谱柱为Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm ,5m)；柱温为30 oC；流速为1.0 mL•min-1；流动相为十二烷基硫酸钠溶液-乙腈-甲醇(500∶500∶60，用磷酸调pH 2.2)；检测波长为254 nm。结果：柔红霉素保留时间19.7 min，盐酸多柔比星保留时间10.9 min，盐酸表柔比星保留时间12.4 min；三种化合物进样量在0.1 2g范围内与峰面积积分值呈良好线性关系；平均回收率为98.4 %~99.0 %，RSD为0.45 %(n=5)；结论：本方法灵敏度高、准确，可以对盐酸多柔比星类化合物进行定性定量分析。
【关键词】柔红霉素；盐酸多柔比星；盐酸表柔比星；高效液相色谱法
HPLC Analysis of Daunorubicin, Doxorubicin and Epirubicin
SHI TaoCHEN Sha-sha ZHU Yu-pengSHANG Guang-dong
【Abstract】Objective: To establish a HPLC method for the analysis of Daunorubicin, Doxorubicin and Epirubicin. METHODS: The determination was performed by HPLC using Agilent HC-C18 column (250 mm x4.6 mm ,5m) with the column temperature maintained at 30 oC. The mobile phase consisted of SDS-acetonitrile-methanol (500∶500∶60, ajust pH 2.2 with H3PO4)at a flow rate of 1.0 mL•min-1 and a UV detection wavelength of 254 nm. RESULTS: The Daunorubicin retention time is 19.7 min ,the Doxorubicin retention time is 10.9 min ,the Epirubicin retention time is 12.4 min; The linear range of the three compounds were 0.1 2g,and the average recoveries of all stood at 98.4 %~99.0 % and RSD at 0.45 %( n = 5 each); CONCLUSION: This method is sensitive, accurate, and it can be used for the qualitative and quantitative analysis of Daunorubicin, Doxorubicin and Epirubicin.
【Key words】Daunorubicin; Doxorubicin; Epirubicin; HPLC
【中图分类号】R414【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)01-0025-02
柔红霉素和盐酸多柔比星为蒽环类抗生素[1]，盐酸多柔比星是柔红霉素的C-14位的羟化产物[2]，盐酸多柔比星氨基糖部分4'位异构化得到活性相当、但毒性减少的盐酸表柔比星[3]，是联合国世界卫生组织推荐的治疗肿瘤化疗的基本药物，在国际和国内市场同类药物中占有较大的份额。目前盐酸多柔比星类化合物主要是通过化学半合成法[4]，问题是化学合成目标产物时可能含有其他的组份，质量控制需要各组份精确分析，因此定性和定量分析就很重要。2005版药典中有介绍盐酸多柔比星类化合物的分析方法，但没有柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星三种化合物的分析方法，故参照有关文献[5]，以高效液相色谱法建立盐酸多柔比星类化合物的分析方法。
1 材料
1100型高效液相色谱仪包括包括G2170AA型PC化学工作站、G1311A型四元梯度泵、G1314A型可变紫外检测器（美国Agilent公司）；ALC-1100.4精密天平（Sarforius公司）；KQ250DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器厂）。柔红霉素（柔红霉素标准品，中国药品生物制品检定所，批号：130559~200501），盐酸多柔比星（Sigma公司，批号：038K1349），注射用盐酸表柔比星（盐酸表柔比星样品，浙江海正药业股份有限公司，批号：090803）；甲醇、乙腈为色谱级，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件:色谱柱：Agilent HC-C18 (250 mm×4.6 mm ,5μm)；柱温：30 oC；流速：1.0 mL•min-1；流动相：十二烷基硫酸钠溶液（1.44 g+0.68 mL H3PO4+H2O+500mL, 用磷酸调pH 2.2）-乙腈-甲醇(500∶500∶60)，检测波长254 nm；进样体积20μL。结果，在此条件下柔红霉素与盐酸多柔比星、盐酸表柔比星色谱峰可基线分离，柔红霉素保留时间19.7 min，盐酸多柔比星保留时间10.9 min，盐酸表柔比星保留时间12.4 min。该条件的建立为盐酸多柔比星类化合物进行定性分析奠定了基础（色谱见图1）。
2.2 样品溶液的制备:称取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品各1 mg，用水溶解配置各自储存液1 mg•mL-1即1μg•μL -1。
2.3 线性关系的考察:精密吸取样品溶液2.5、5、10、25、50、100μL，分别置于1.5 mL eppendorf管中，用流动相稀释至1 mL，摇匀，精密吸取系列溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量（X,μg）为横坐标，峰面积的积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，得到回归方程及线性范围，回归方程的建立为盐酸多柔比星类化合物的定量分析奠定基础。结果见表1。
图1 高效液相色谱
A.柔红霉素；B.盐酸多柔比星；C.盐酸表柔比星；D.三种标准品的混合物：1，盐酸多柔比星；2，盐酸表柔比星；3，柔红霉素
2.4 最低检测限测定:将样品溶液逐步稀释，直至信噪比(S/ N) ≥3 ,此时的进样浓度即为检测限。以S/ N = 3 :1 确定的柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星的最低检测浓度均为2.5μg•mL-1，检测限为50 ng。
2.5 稳定性试验:取同一样品溶液,分别在0 、2 、4 、6 、8 、12 、24 h 测定峰面积。结果，柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星RSD均<2.0%，表明供试品溶液在24h 内稳定性良好。
2.6 精密度试验:取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品各1mg ，按“2.2”项下方法制备样品溶液，吸取20μL 注入液相色谱仪，重复进样6 次，按上述色谱条件测定峰面积。结果，柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星RSD 均<2.0%，表明方法精密度良好。
2.7 重现性试验:取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品，精密称取6份，每份约1mg，按“2.2”项下方法制备样品溶液，吸取20μL注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定。结果，柔红霉素、盐酸多柔比星和表阿霉RSD 均< 10.0 %表明方法重现性良好。
2.8 加样回收率试验:取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品5μg各5份，分别加入一定量的水溶解，用旋转蒸发仪40oC蒸馏浓缩，加500μL水洗出，按上述色谱条件测定峰面积，对照线性回归方程计算样品的回收率，结果见表2。
3 讨论
目前，采用HPLC 法分别测定柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星文献报道较多，但采用同一个色谱条件来测定这3 种化合物未见报道。本试验发现：Agilent HC-C18柱，柱温30oC，流速1.0mL•min-1，流动相SDS-乙腈-甲醇(500∶500∶60，用磷酸调pH2.2)，检测波长254 nm，3 种化合物分离效果很好。初步分析原因在于三种化合物的结构差异性：盐酸多柔比星比柔红霉素C-14位多了一个羟基，加大了盐酸多柔比星的极性，其保留时间要早于柔红霉素；盐酸表柔比星是盐酸多柔比星结构的异构化，保留时间肯定与盐酸多柔比星不一致。同时用磷酸调pH2.2使呈弱酸性能够提高柱效及分离度。本方法准确、灵敏度高、重现性好、可用于盐酸多柔比星类化合物的定性定量分析，盐酸多柔比星制剂的质量控制。
参考文献
[1] Hutchinson CR. Biosynthetic Studies of Daunorubicin and Tetracenomycin C[J]. Chem Rev,1997,97(7):2525~36
[2] Gallo MA, Ward J, Hutchinson CR. The dnrM gene in Streptomyces peucetius contains a naturally occurring frameshift mutation that is suppressed by another locus outside of the daunorubicin-production gene cluster[J]. Microbiology, 1996,142 ( Pt 2):269~75
[3] 胡友佳，朱春宝，朱宝泉.代谢工程研究及其在柔红霉素产生菌中的应用[J].中国医药工业杂志，2007,38(3):164~169
[4] Madduri K, Kennedy J, Rivola G, et al. Production of the antitumor drug epirubicin (4'-epidoxorubicin) and its precursor by a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius[J]. Nat Biotechnol,1998,16(1):69~74
[5] 国家药典委员会编. 中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005:505~505,557~558
作者单位：210009 东南大学附属中大医院1
210046 南京师范大学生命科学学院2
【关键词】柔红霉素；盐酸多柔比星；盐酸表柔比星；高效液相色谱法
HPLC Analysis of Daunorubicin, Doxorubicin and Epirubicin
SHI TaoCHEN Sha-sha ZHU Yu-pengSHANG Guang-dong
【Abstract】Objective: To establish a HPLC method for the analysis of Daunorubicin, Doxorubicin and Epirubicin. METHODS: The determination was performed by HPLC using Agilent HC-C18 column (250 mm x4.6 mm ,5m) with the column temperature maintained at 30 oC. The mobile phase consisted of SDS-acetonitrile-methanol (500∶500∶60, ajust pH 2.2 with H3PO4)at a flow rate of 1.0 mL•min-1 and a UV detection wavelength of 254 nm. RESULTS: The Daunorubicin retention time is 19.7 min ,the Doxorubicin retention time is 10.9 min ,the Epirubicin retention time is 12.4 min; The linear range of the three compounds were 0.1 2g,and the average recoveries of all stood at 98.4 %~99.0 % and RSD at 0.45 %( n = 5 each); CONCLUSION: This method is sensitive, accurate, and it can be used for the qualitative and quantitative analysis of Daunorubicin, Doxorubicin and Epirubicin.
【Key words】Daunorubicin; Doxorubicin; Epirubicin; HPLC
【中图分类号】R414【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)01-0025-02
柔红霉素和盐酸多柔比星为蒽环类抗生素[1]，盐酸多柔比星是柔红霉素的C-14位的羟化产物[2]，盐酸多柔比星氨基糖部分4'位异构化得到活性相当、但毒性减少的盐酸表柔比星[3]，是联合国世界卫生组织推荐的治疗肿瘤化疗的基本药物，在国际和国内市场同类药物中占有较大的份额。目前盐酸多柔比星类化合物主要是通过化学半合成法[4]，问题是化学合成目标产物时可能含有其他的组份，质量控制需要各组份精确分析，因此定性和定量分析就很重要。2005版药典中有介绍盐酸多柔比星类化合物的分析方法，但没有柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星三种化合物的分析方法，故参照有关文献[5]，以高效液相色谱法建立盐酸多柔比星类化合物的分析方法。
1 材料
1100型高效液相色谱仪包括包括G2170AA型PC化学工作站、G1311A型四元梯度泵、G1314A型可变紫外检测器（美国Agilent公司）；ALC-1100.4精密天平（Sarforius公司）；KQ250DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器厂）。柔红霉素（柔红霉素标准品，中国药品生物制品检定所，批号：130559~200501），盐酸多柔比星（Sigma公司，批号：038K1349），注射用盐酸表柔比星（盐酸表柔比星样品，浙江海正药业股份有限公司，批号：090803）；甲醇、乙腈为色谱级，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件:色谱柱：Agilent HC-C18 (250 mm×4.6 mm ,5μm)；柱温：30 oC；流速：1.0 mL•min-1；流动相：十二烷基硫酸钠溶液（1.44 g+0.68 mL H3PO4+H2O+500mL, 用磷酸调pH 2.2）-乙腈-甲醇(500∶500∶60)，检测波长254 nm；进样体积20μL。结果，在此条件下柔红霉素与盐酸多柔比星、盐酸表柔比星色谱峰可基线分离，柔红霉素保留时间19.7 min，盐酸多柔比星保留时间10.9 min，盐酸表柔比星保留时间12.4 min。该条件的建立为盐酸多柔比星类化合物进行定性分析奠定了基础（色谱见图1）。
2.2 样品溶液的制备:称取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品各1 mg，用水溶解配置各自储存液1 mg•mL-1即1μg•μL -1。
2.3 线性关系的考察:精密吸取样品溶液2.5、5、10、25、50、100μL，分别置于1.5 mL eppendorf管中，用流动相稀释至1 mL，摇匀，精密吸取系列溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量（X,μg）为横坐标，峰面积的积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，得到回归方程及线性范围，回归方程的建立为盐酸多柔比星类化合物的定量分析奠定基础。结果见表1。
图1 高效液相色谱
A.柔红霉素；B.盐酸多柔比星；C.盐酸表柔比星；D.三种标准品的混合物：1，盐酸多柔比星；2，盐酸表柔比星；3，柔红霉素
2.4 最低检测限测定:将样品溶液逐步稀释，直至信噪比(S/ N) ≥3 ,此时的进样浓度即为检测限。以S/ N = 3 :1 确定的柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星的最低检测浓度均为2.5μg•mL-1，检测限为50 ng。
2.5 稳定性试验:取同一样品溶液,分别在0 、2 、4 、6 、8 、12 、24 h 测定峰面积。结果，柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星RSD均<2.0%，表明供试品溶液在24h 内稳定性良好。
2.6 精密度试验:取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品各1mg ，按“2.2”项下方法制备样品溶液，吸取20μL 注入液相色谱仪，重复进样6 次，按上述色谱条件测定峰面积。结果，柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星RSD 均<2.0%，表明方法精密度良好。
2.7 重现性试验:取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品，精密称取6份，每份约1mg，按“2.2”项下方法制备样品溶液，吸取20μL注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定。结果，柔红霉素、盐酸多柔比星和表阿霉RSD 均< 10.0 %表明方法重现性良好。
2.8 加样回收率试验:取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品5μg各5份，分别加入一定量的水溶解，用旋转蒸发仪40oC蒸馏浓缩，加500μL水洗出，按上述色谱条件测定峰面积，对照线性回归方程计算样品的回收率，结果见表2。
3 讨论
目前，采用HPLC 法分别测定柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星文献报道较多，但采用同一个色谱条件来测定这3 种化合物未见报道。本试验发现：Agilent HC-C18柱，柱温30oC，流速1.0mL•min-1，流动相SDS-乙腈-甲醇(500∶500∶60，用磷酸调pH2.2)，检测波长254 nm，3 种化合物分离效果很好。初步分析原因在于三种化合物的结构差异性：盐酸多柔比星比柔红霉素C-14位多了一个羟基，加大了盐酸多柔比星的极性，其保留时间要早于柔红霉素；盐酸表柔比星是盐酸多柔比星结构的异构化，保留时间肯定与盐酸多柔比星不一致。同时用磷酸调pH2.2使呈弱酸性能够提高柱效及分离度。本方法准确、灵敏度高、重现性好、可用于盐酸多柔比星类化合物的定性定量分析，盐酸多柔比星制剂的质量控制。
参考文献
[1] Hutchinson CR. Biosynthetic Studies of Daunorubicin and Tetracenomycin C[J]. Chem Rev,1997,97(7):2525~36
[2] Gallo MA, Ward J, Hutchinson CR. The dnrM gene in Streptomyces peucetius contains a naturally occurring frameshift mutation that is suppressed by another locus outside of the daunorubicin-production gene cluster[J]. Microbiology, 1996,142 ( Pt 2):269~75
[3] 胡友佳，朱春宝，朱宝泉.代谢工程研究及其在柔红霉素产生菌中的应用[J].中国医药工业杂志，2007,38(3):164~169
[4] Madduri K, Kennedy J, Rivola G, et al. Production of the antitumor drug epirubicin (4'-epidoxorubicin) and its precursor by a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius[J]. Nat Biotechnol,1998,16(1):69~74
[5] 国家药典委员会编. 中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005:505~505,557~558
作者单位：210009 东南大学附属中大医院1
210046 南京师范大学生命科学学院2