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[摘要]目的：探讨转化生长因子β1(TGF-β1)基因-509C/T多态性与中国汉族人群病理性瘢痕的相关关系。方法：采用聚合酶链反应-反向点杂交、DNA直接测序方法检测了155例病理性瘢痕患者与120名正常对照的TGF-β1基因-509C/T多态性位点的基因型。结果：病理性瘢痕患者的C等位基因频率明显高于正常对照组(χ2=4.676,P=0.031)。病理性瘢痕患者的C/T、T/T基因型频率与正常对照组相比差异无统计学意义(χ2值分别为0.763和1.376;P值分别为0.382和0.241)，而病理性瘢痕患者的C/C基因型频率明显高于对照组(χ2=5.493,P=0.019)。提示C/C基因型者患病理性瘢痕的风险性明显高于C/T、T/T基因型者(OR=2.041,95%CI:1.116～3.73)。结论：TGF-β1基因-509位点C等位基因及C/C基因型可能是病理性瘢痕的易感因素。
[关键词]病理性瘢痕；TGF-β1基因；多态性；遗传易感性
[中图分类号]Q813[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）08-1170-03
TGFβ1-509C/T polymorphism and susceptibility to abnormal scar in Han Nationality of Chinese population
ZHUO Yang,ZENG Xing-ye,ZHOU Xue-xue,HUANG Da-dao,PAN Ruo-wang,CAO Xiao-en
（Department of Surgery,the 118th Hospital of PLA,Wenzhou 325000，Hangzhou,China）
Abstract： ObjectiveTo investigate the relationship between TGFβ1-509C/T polymorphism and susceptibility to abnormal scar in a southern Chinese population.MethodsThe TGFβ1-509 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) and DNA direct sequencing in 155 patients with abnormal scar and 120 unrelated healthy controls. ResultsThe frequency of the TGFβ1-509 C allele among abnormal scar patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=4.676,P=0.031). The C/T and T/T genotype distribution among abnormal scar patients was not significantly different from that among healthy controls(χ2=0.763and 1.376; P=0.382 and 0.241, respectively). However, the C/C genotype frequency among abnormal scar patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=5.493,P=0.019). The TGFβ1-509 C/C genotype significantly increased the risk for developing abnormal scar,compared to the combination of C/T and T/T genotypes,with the odds ratio(OR) of 2.041, (95%CI: 1.116～3.731).ConclusionTheTGFβ1-509 polymorphism may play a role in susceptibility to abnormal scar.
Key words: abnormal scar; TGFβ1 gene ; polymorphism; genetic susceptibility
瘢痕形成是高等哺乳动物创伤愈合的自然结局，但瘢痕异常增生则会产生病理性瘢痕，特别是发生于头颈部者可造成面容畸形、器官移位和功能障碍，尤其是对于患者心理方面造成的影响常会严重干扰其正常工作和生活。因而，研究瘢痕形成与增生的机理及其防治措施，是目前医学整形美容领域内函待解决的问题之一。
TGF-β1基因是目前较为关注的与病理性瘢痕相关的基因之一，分子生物学研究表明TGF-β1存在着基因变异及基因多态性,而关于TGF-β1基因多态现象与病理性瘢痕的关系鲜见报道,为此,我们从分子遗传学角度探讨TGF-β1基因-509C/T多态性与浙江地区汉族人群病理性瘢痕发病风险的关系, 以便深入地, 多层次的解析病理性瘢痕的分子生物学机制。
1对象和方法
1.1 研究对象：病理性瘢痕患者和正常对照人群均为浙江地区居民。病理性瘢痕患者均经本院临床及病理诊断证实，共155例，其中男96例、女59例，年龄10～56岁，平均年龄27.6岁，病变位于颈肩、胸部、腋下及上下肢关节等部位，病史5个月～12年。正常对照为有外伤史而无增生性瘢痕或病理性瘢痕产生的健康居民，共120例，其中男63例、女57例,年龄13～58岁,平均年龄28.4岁。用于基因分析的DNA全部来源于研究对象的外周静脉血，血样本用枸橼酸钠抗凝，置于-80℃保存备用。
1.2 聚合酶链反应-反向点杂交（PCR-RDB）
1.2.1基因组DNA提取：采用北京赛百胜生物技术有限公司的基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
1.2.2 ASO（等位基因特异性寡核苷酸）探针设计：应用Primer Premier5.0设计探针，氨基标记，探针序列分别为：NH2-5′- CTTCCATCCCTCAGGTGTCC-3′；NH2-5′- CTTCCATCCTTCAGGTGTCC -3′，由上海生工生物公司合成。
1.2.3 PCR反应：用于扩增TGF-β1基因-509位点的引物5′端标记了非同位素检测介质Biotin,引物序列为：Bio-5′- CAGACTCTAGAGACTGTCAG -3′；Bio-5′- GTCACCAGAGAAAGAGGAC -3′，由上海生工生物公司合成。反应在PE-480型扩增仪(美国PE公司)上进行。在50μl反应总体积中,含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎国生物公司)。热循环参数：94℃热启动5min后，94℃40sec，55℃1min，72℃/2min；共35个循环 72℃延伸 5min。取3μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色,紫外透射仪下观察结果。
1.2.4 杂交：固化上寡核苷酸探针的膜条连同40μlPCR产物加入含5ml2×SSC～0.1%SDS的试管中，100℃水浴变性7min，置杂交仪中42℃杂交3～6h；然后放入42℃预热的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；将膜条转入含2.5U辣根过氧化物酶连链酶抗生素蛋白的10ml2×SSC～0.1%SDS试管中，室温反应15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，将膜条转入20ml显色液[19ml0.1mol/L柠檬酸钠(pH5.0)中加30%过氧化氢3μl和0.1mg/mlTMB]中避光显色5～15min,期间观察、记录结果。
1.3 为检验反向点杂交结果的正确性，随机抽取15例PCR扩增产物送上海生工生物公司测序。
1.4 统计学处理：应用SPSS10.0统计软件包处理数据，采用χ2检验分析各组等位基因和基因型频率分布的差异，并计算表示相对风险度的比值比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidenceinterval,CI)。
2结果
根据我们设计的方案，杂交结束后膜条上格显示蓝紫色斑点为C/C基因型，中格显示蓝紫色斑点为T/T基因型，而上、中全部显示为C/T基因型，下格为空白对照，无斑点显示（图1）。病理性瘢痕组和正常对照组TGF-β1基因多态性比较如表1所示。
病理性瘢痕组的C等位基因频率(49.7%)明显高于正常对照组(40.4%，χ2=4.676,P=0.031, P＜0.05)。病理性瘢痕组的C/T、T/T基因型频率分别为43.9%和28.4%，与正常对照组相比差异无统计学意义(χ2值分别为0.763和1.376；P值分别为0.382和0.241)。而病理性瘢痕组的C/C 基因型频率为27.7%，明显高于正常对照组(χ2=5.493,P=0.019,P＜0.05)。与C/T、T/T基因型相比， C/C基因型者患病理性瘢痕的相对风险性(OR)明显增高(OR=2.041,95%CI:1.116～3.731)。
我们随机抽取的15例PCR扩增产物测序结果与反向点杂交结果完全吻合，证明了聚合酶链反应-反向点杂交结果的正确性。
3讨论
外伤、感染、烧伤、外科手术等均可造成病理性瘢痕。一直以来，病理性瘢痕被认为是由于各种原因引起成纤维细胞的异常增殖和胶原纤维大量合成，导致细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）中胶原过度沉积所致[1]。其中，成纤维细胞又被认为是病理性瘢痕形成的关键效应细胞，其功能状态是影响病理性瘢痕发生、发展以及转归的主要因素。而目前其产生的深入内因、形成的机制尚未完全清楚[2]，并且在临床工作中也缺乏有效、可靠的治疗方法。
近年来，随着现代医学的发展进入到细胞生物学和分子生物学水平，在该领域开展的基础研究也取得一定进展，并已将成果应用于临床治疗。特别是细胞因子在病理性瘢痕的形成中所起重要调节作用已越来越受到广泛关注。细胞因子是一种存在于人体中极微量的活性物质，由活化的免疫细胞和某些基质细胞所分泌，介导和调节免疫及炎症反应的一类小分子多肽，作为细胞外基质间的一种重要的信号传导介质，它们参与调节成纤维细胞的转化、增殖、代谢凋亡过程，在创伤修复和瘢痕形成过程中发挥重要调节作用[3]。其中，转化生长因子β1（transforming growth factor-β1TGFβ1）的作用尤为重要。TGF-β1基因位于第19号染色体长臂上,含7个外显子和6个内含子,是一种具有多种生物学效应的细胞因子，在胚胎发育和组织损伤的修复和更新中起重要作用，影响伤口愈合过程的所有阶段，包括炎症反应和细胞外基质积累。目前普遍认为TGF-β1与病理性瘢痕形成有密切联系，这一点已被大量实验所证实[4-5]。
分子生物学研究表明TGF-β1基因存在着基因变异及基因多态性,这种基因多态性与多种疾病存在密切相关性[6-7]，而与中国汉族人群病理性瘢痕是否相关,目前国内、外鲜见文献报道。本实验中，研究对象基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，表明其基因频率已达到遗传平衡并具有群体代表性。研究初步结果提示，TGF-β1基因-509位点C等位基因及CC基因型是中国浙江地区人群对病理性瘢痕的易感因素。可以推测,在组织局部分泌TGF-β1机制中,该位点不同基因型可以通过调节TGFβ1mRNA的转录活性的高低,进而影响TGF-β1蛋白表达量的多少。我们的初步研究结果对病理性瘢痕的预测诊断及筛选具有较大潜在的临床意义，然而更大样本、更多地域、多民族的印证研究尚有待完善。
本实验采用的聚合酶链反应-反向点杂交方法是由Saiki RK[8]于1989年首次提出，虽然在原理上与正向斑点杂交相似，但却巧妙地反其道而用之,即反方向的将各种探针固定在基质上,用以检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。近年来应用此法进行β-地中海贫血、囊肿性纤维化等疾病的基因诊断，取得较好效果。该方法分辨率高，技术简便、快速、可靠，其检测结果与DNA测序符合率高，值得推广应用。
[参考文献]
[1]Oyama A. High expression of macrophage migration inhibitory factor and its role in cellular proliferation and extracellular matrix production in keloid fibroblasts[J]. Hokkaido Igaku Zasshi, 2003,78(6):529-539.
[2]Wu Y, Zhang Q, Ann DK,et al.Increased vascular endothelial growth factor may account for elevated level of plasminogen activator inhibitor-1 via activating ERK1/2 in keloid fibroblasts[J].Am J Physiol Cell Physiol, 2004,286(4):C905-912.
[3]Widgerow AD, Chait LA, Stals R, et al.New innovations in scar management[J].Aesthetic Plast Surg, 2000,24(3):227-234.
[4]Schultze-Mosgau S, Blaese MA, Grabenbauer G,et al.Smad-3 and Smad-7 expression following anti-transforming growth factor beta 1 (TGFbeta1)-treatment in irradiated rat tissue[J]. Radiother Oncol, 2004,70(3):249-259.
[5]Flanders KC, Major CD, Arabshahi A, et al.Interference with transforming growth factor-beta/ Smad3 signaling results in accelerated healing of wounds in previously irradiated skin[J]. Am J Pathol,2003,163(6):2247-2257.
[6]Dunning AM, Ellis PD ,McBride S, et al . A transforming growth factor betal signal peptide variant increases secretion in vitro and is associated with increased incidence of invasive breast cancer[J].Cancer Res,2003,63(10) :2610-2615.
[7]Li Z ,Habuchi T,Tsuchiya N,et al. Increased risk of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia associated with transforming growth factor2be2ta 1 gene polymorphism at codon10[J].Carcinogenesis,2004,25(2):237-240.
[8]Saiki RK,Walsh PS,Levenson CH.Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 1989,86:6230-6234.
[收稿日期]2008-03-06 [修回日期]2008-06-16
编辑/张惠娟
[关键词]病理性瘢痕；TGF-β1基因；多态性；遗传易感性
[中图分类号]Q813[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）08-1170-03
TGFβ1-509C/T polymorphism and susceptibility to abnormal scar in Han Nationality of Chinese population
ZHUO Yang,ZENG Xing-ye,ZHOU Xue-xue,HUANG Da-dao,PAN Ruo-wang,CAO Xiao-en
（Department of Surgery,the 118th Hospital of PLA,Wenzhou 325000，Hangzhou,China）
Abstract： ObjectiveTo investigate the relationship between TGFβ1-509C/T polymorphism and susceptibility to abnormal scar in a southern Chinese population.MethodsThe TGFβ1-509 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) and DNA direct sequencing in 155 patients with abnormal scar and 120 unrelated healthy controls. ResultsThe frequency of the TGFβ1-509 C allele among abnormal scar patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=4.676,P=0.031). The C/T and T/T genotype distribution among abnormal scar patients was not significantly different from that among healthy controls(χ2=0.763and 1.376; P=0.382 and 0.241, respectively). However, the C/C genotype frequency among abnormal scar patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=5.493,P=0.019). The TGFβ1-509 C/C genotype significantly increased the risk for developing abnormal scar,compared to the combination of C/T and T/T genotypes,with the odds ratio(OR) of 2.041, (95%CI: 1.116～3.731).ConclusionTheTGFβ1-509 polymorphism may play a role in susceptibility to abnormal scar.
Key words: abnormal scar; TGFβ1 gene ; polymorphism; genetic susceptibility
瘢痕形成是高等哺乳动物创伤愈合的自然结局，但瘢痕异常增生则会产生病理性瘢痕，特别是发生于头颈部者可造成面容畸形、器官移位和功能障碍，尤其是对于患者心理方面造成的影响常会严重干扰其正常工作和生活。因而，研究瘢痕形成与增生的机理及其防治措施，是目前医学整形美容领域内函待解决的问题之一。
TGF-β1基因是目前较为关注的与病理性瘢痕相关的基因之一，分子生物学研究表明TGF-β1存在着基因变异及基因多态性,而关于TGF-β1基因多态现象与病理性瘢痕的关系鲜见报道,为此,我们从分子遗传学角度探讨TGF-β1基因-509C/T多态性与浙江地区汉族人群病理性瘢痕发病风险的关系, 以便深入地, 多层次的解析病理性瘢痕的分子生物学机制。
1对象和方法
1.1 研究对象：病理性瘢痕患者和正常对照人群均为浙江地区居民。病理性瘢痕患者均经本院临床及病理诊断证实，共155例，其中男96例、女59例，年龄10～56岁，平均年龄27.6岁，病变位于颈肩、胸部、腋下及上下肢关节等部位，病史5个月～12年。正常对照为有外伤史而无增生性瘢痕或病理性瘢痕产生的健康居民，共120例，其中男63例、女57例,年龄13～58岁,平均年龄28.4岁。用于基因分析的DNA全部来源于研究对象的外周静脉血，血样本用枸橼酸钠抗凝，置于-80℃保存备用。
1.2 聚合酶链反应-反向点杂交（PCR-RDB）
1.2.1基因组DNA提取：采用北京赛百胜生物技术有限公司的基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
1.2.2 ASO（等位基因特异性寡核苷酸）探针设计：应用Primer Premier5.0设计探针，氨基标记，探针序列分别为：NH2-5′- CTTCCATCCCTCAGGTGTCC-3′；NH2-5′- CTTCCATCCTTCAGGTGTCC -3′，由上海生工生物公司合成。
1.2.3 PCR反应：用于扩增TGF-β1基因-509位点的引物5′端标记了非同位素检测介质Biotin,引物序列为：Bio-5′- CAGACTCTAGAGACTGTCAG -3′；Bio-5′- GTCACCAGAGAAAGAGGAC -3′，由上海生工生物公司合成。反应在PE-480型扩增仪(美国PE公司)上进行。在50μl反应总体积中,含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎国生物公司)。热循环参数：94℃热启动5min后，94℃40sec，55℃1min，72℃/2min；共35个循环 72℃延伸 5min。取3μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色,紫外透射仪下观察结果。
1.2.4 杂交：固化上寡核苷酸探针的膜条连同40μlPCR产物加入含5ml2×SSC～0.1%SDS的试管中，100℃水浴变性7min，置杂交仪中42℃杂交3～6h；然后放入42℃预热的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；将膜条转入含2.5U辣根过氧化物酶连链酶抗生素蛋白的10ml2×SSC～0.1%SDS试管中，室温反应15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，将膜条转入20ml显色液[19ml0.1mol/L柠檬酸钠(pH5.0)中加30%过氧化氢3μl和0.1mg/mlTMB]中避光显色5～15min,期间观察、记录结果。
1.3 为检验反向点杂交结果的正确性，随机抽取15例PCR扩增产物送上海生工生物公司测序。
1.4 统计学处理：应用SPSS10.0统计软件包处理数据，采用χ2检验分析各组等位基因和基因型频率分布的差异，并计算表示相对风险度的比值比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidenceinterval,CI)。
2结果
根据我们设计的方案，杂交结束后膜条上格显示蓝紫色斑点为C/C基因型，中格显示蓝紫色斑点为T/T基因型，而上、中全部显示为C/T基因型，下格为空白对照，无斑点显示（图1）。病理性瘢痕组和正常对照组TGF-β1基因多态性比较如表1所示。
病理性瘢痕组的C等位基因频率(49.7%)明显高于正常对照组(40.4%，χ2=4.676,P=0.031, P＜0.05)。病理性瘢痕组的C/T、T/T基因型频率分别为43.9%和28.4%，与正常对照组相比差异无统计学意义(χ2值分别为0.763和1.376；P值分别为0.382和0.241)。而病理性瘢痕组的C/C 基因型频率为27.7%，明显高于正常对照组(χ2=5.493,P=0.019,P＜0.05)。与C/T、T/T基因型相比， C/C基因型者患病理性瘢痕的相对风险性(OR)明显增高(OR=2.041,95%CI:1.116～3.731)。
我们随机抽取的15例PCR扩增产物测序结果与反向点杂交结果完全吻合，证明了聚合酶链反应-反向点杂交结果的正确性。
3讨论
外伤、感染、烧伤、外科手术等均可造成病理性瘢痕。一直以来，病理性瘢痕被认为是由于各种原因引起成纤维细胞的异常增殖和胶原纤维大量合成，导致细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）中胶原过度沉积所致[1]。其中，成纤维细胞又被认为是病理性瘢痕形成的关键效应细胞，其功能状态是影响病理性瘢痕发生、发展以及转归的主要因素。而目前其产生的深入内因、形成的机制尚未完全清楚[2]，并且在临床工作中也缺乏有效、可靠的治疗方法。
近年来，随着现代医学的发展进入到细胞生物学和分子生物学水平，在该领域开展的基础研究也取得一定进展，并已将成果应用于临床治疗。特别是细胞因子在病理性瘢痕的形成中所起重要调节作用已越来越受到广泛关注。细胞因子是一种存在于人体中极微量的活性物质，由活化的免疫细胞和某些基质细胞所分泌，介导和调节免疫及炎症反应的一类小分子多肽，作为细胞外基质间的一种重要的信号传导介质，它们参与调节成纤维细胞的转化、增殖、代谢凋亡过程，在创伤修复和瘢痕形成过程中发挥重要调节作用[3]。其中，转化生长因子β1（transforming growth factor-β1TGFβ1）的作用尤为重要。TGF-β1基因位于第19号染色体长臂上,含7个外显子和6个内含子,是一种具有多种生物学效应的细胞因子，在胚胎发育和组织损伤的修复和更新中起重要作用，影响伤口愈合过程的所有阶段，包括炎症反应和细胞外基质积累。目前普遍认为TGF-β1与病理性瘢痕形成有密切联系，这一点已被大量实验所证实[4-5]。
分子生物学研究表明TGF-β1基因存在着基因变异及基因多态性,这种基因多态性与多种疾病存在密切相关性[6-7]，而与中国汉族人群病理性瘢痕是否相关,目前国内、外鲜见文献报道。本实验中，研究对象基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，表明其基因频率已达到遗传平衡并具有群体代表性。研究初步结果提示，TGF-β1基因-509位点C等位基因及CC基因型是中国浙江地区人群对病理性瘢痕的易感因素。可以推测,在组织局部分泌TGF-β1机制中,该位点不同基因型可以通过调节TGFβ1mRNA的转录活性的高低,进而影响TGF-β1蛋白表达量的多少。我们的初步研究结果对病理性瘢痕的预测诊断及筛选具有较大潜在的临床意义，然而更大样本、更多地域、多民族的印证研究尚有待完善。
本实验采用的聚合酶链反应-反向点杂交方法是由Saiki RK[8]于1989年首次提出，虽然在原理上与正向斑点杂交相似，但却巧妙地反其道而用之,即反方向的将各种探针固定在基质上,用以检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。近年来应用此法进行β-地中海贫血、囊肿性纤维化等疾病的基因诊断，取得较好效果。该方法分辨率高，技术简便、快速、可靠，其检测结果与DNA测序符合率高，值得推广应用。
[参考文献]
[1]Oyama A. High expression of macrophage migration inhibitory factor and its role in cellular proliferation and extracellular matrix production in keloid fibroblasts[J]. Hokkaido Igaku Zasshi, 2003,78(6):529-539.
[2]Wu Y, Zhang Q, Ann DK,et al.Increased vascular endothelial growth factor may account for elevated level of plasminogen activator inhibitor-1 via activating ERK1/2 in keloid fibroblasts[J].Am J Physiol Cell Physiol, 2004,286(4):C905-912.
[3]Widgerow AD, Chait LA, Stals R, et al.New innovations in scar management[J].Aesthetic Plast Surg, 2000,24(3):227-234.
[4]Schultze-Mosgau S, Blaese MA, Grabenbauer G,et al.Smad-3 and Smad-7 expression following anti-transforming growth factor beta 1 (TGFbeta1)-treatment in irradiated rat tissue[J]. Radiother Oncol, 2004,70(3):249-259.
[5]Flanders KC, Major CD, Arabshahi A, et al.Interference with transforming growth factor-beta/ Smad3 signaling results in accelerated healing of wounds in previously irradiated skin[J]. Am J Pathol,2003,163(6):2247-2257.
[6]Dunning AM, Ellis PD ,McBride S, et al . A transforming growth factor betal signal peptide variant increases secretion in vitro and is associated with increased incidence of invasive breast cancer[J].Cancer Res,2003,63(10) :2610-2615.
[7]Li Z ,Habuchi T,Tsuchiya N,et al. Increased risk of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia associated with transforming growth factor2be2ta 1 gene polymorphism at codon10[J].Carcinogenesis,2004,25(2):237-240.
[8]Saiki RK,Walsh PS,Levenson CH.Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 1989,86:6230-6234.
[收稿日期]2008-03-06 [修回日期]2008-06-16
编辑/张惠娟