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【摘要】 目的：探讨腹腔镜直肠癌根治术对进展期直肠癌患者微转移的影响。方法：选取2013年
4月-2017年4月本院普外科收治的160例进展期直肠癌患者作为研究对象，按照手术方式分为腔镜组与开腹组，各80例。采用RT-PCR方法检测所有入选者术前和术后外周血的CK20 mRNA，对其进行定性检测和定量检测。比较手术前后两组外周血CK20 mRNA阳性率，比较腔镜组不同TNM分期患者手术前后外周血CK20 mRNA的OD值。结果：两组术前及术后CK20 mRNA阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。腔镜组Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ期患者术后外周血CK20 mRNA的OD值与术前比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；术前和术后，Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ期CK20 mRNA的OD值均依次递增（P<0.05）。结论：腹腔镜手术并不增加进展期直肠癌的微转移风险，微转移的数量只与肿瘤的进展程度有关。
【关键词】 腹腔镜； 直肠癌根治术； 进展期直肠癌； 微转移
【Abstract】 Objective：To investigate the effect of laparoscopic radical resection of rectal cancer on micrometastasis in patients with advanced rectal cancer.Method：A total of 160 patients with advanced rectal cancer were enrolled in this study from April 2013 to April 2017 in our hospital and they were divided into laparoscopic group and laparotomy group according to the surgical method， 80 cases in each group.RT-PCR was used to detect CK20 mRNA in preoperative and postoperative peripheral blood samples with qualitative and quantitative detection.The positive rate of CK20 mRNA in the peripheral blood of two groups was compared，the OD value of the CK20 mRNA in the peripheral blood of patients with different TNM staging in laparoscopic group were compared.Result：There were no statistical significances in the positive rate of CK20 mRNA of two groups before and after operation（P>0.05）.Compared before and after operation，there were no statistical significances in the OD value of CK20 mRNA in peripheral blood of patients with stageⅠ，Ⅱ and Ⅲ in laparoscopic group（P>0.05）；but preoperative and postoperative，the OD value of CK20 mRNA in stage Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ were gradually increased（P<0.05）.Conclusion：Laparoscopic surgery can not increase the risk of micrometastasis in advanced rectal cancer，the number of micrometastases is only related to the degree of tumor progression.
【Key words】 Laparoscopy； Rectal cancer radical surgery； Advanced rectal cancer； Micrometastasis
First-author’s address：The Shawan People’s Hospital in Panyu District of Guangzhou City，Guangzhou 511400，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.21.039
微轉移通常是指隐性转移，大多数转移灶都是由微转移发展而来[1]。近年来，越来越多的胃肠肿瘤手术在腹腔镜下开展，因此腔镜下直肠癌根治术是否会对进展期直肠癌患者的微转移产生影响开始受到临床医生的关注。本研究以本院普外科160例进展期直肠癌患者作为研究对象，用CK20作为血液微转移的标记物，对上述问题进行讨论，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2013年4月-2017年4月本院普外科收治的160例进展期直肠癌患者作为研究对象，按照手术方式分为腔镜组与开腹组，各80例。入选标准：（1）术前经直肠镜、病理检查确诊为直肠癌；（2）术前经影像学检查确定TNM分期为Ⅰ～Ⅲ期；（3）术前评估ASA≤3分。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）接受过放、化疗；（3）既往有其他腹部手术史；（4）术前TNM分期为Ⅳ期。腔镜组中，男42例，女38例，年龄37～73岁，平均（58.64±6.59）岁，Ⅰ期9例，Ⅱ期45例，Ⅲ期26例；开腹组中，男45例，女35例，年龄39～77岁，平均（59.13±6.74）岁，Ⅰ期12例，Ⅱ期47例，Ⅲ期21例。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 方法
1.2.1 手术原则 严格遵循直肠癌根治原则和手术无瘤原则，所有入选病例的手术过程均由同一组医师实施。
1.2.2 标本采集 所有患者手术前1 d于清晨空腹状态下采集肘静脉血5 mL，腔镜组在气腹结束后采集肘静脉血5 mL，开腹组在手术后立即采集肘静脉血5 mL。EDTA抗凝，离心去上清后-80 ℃冰箱保存。
1.2.3 CK20 mRNA检测 RT-PCR方法检测，步骤如下：（1）单核细胞分离：标本解冻，取2.5 mL后置于无菌管中，加入Tris 250 μL，12 000 r/min离心5 min后去上清，沉淀物加入PBS缓冲液500 μL悬浮，继续12 000 r/min离心5 min后去上清；（2）提取RNA：加入RNA提取液，75%乙醇200 μL漂洗，离心后吸干，无水酶溶解RNA；（3）RT-PCR反应：70 ℃预变性5 min，冰浴防止复性，取RT反应液18 μL、逆转录酶1 μL、RNasin 1 μL加入无菌离心管并混匀，在每个反应管中加入20 μL上述反应液和预变性的RNA 5 μL，37 ℃水浴30 min；（4）PCR扩增：取PCR反应液43 μL、Taq酶2 μL置于无菌离心管混匀，加入RT-PCR反应产物进行扩增，按变性、退火、延伸的步骤35个循环，最终于4 ℃保存。
1.2.4 产物分析 （1）定性分析：将产物以2%琼脂糖凝胶电泳，紫外成像仪下观察，于370 bp处呈清晰条带状者即为阳性，反之为阴性；（2）定量分析：取阳性产物，采用图像分析仪器测定其光密度OD值，分析其产物量。
1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组手术前后外周血CK20 mRNA阳性率比较 两组术前及术后CK20 mRNA阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；腔镜组术后与术前外周血CK20 mRNA阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；开腹组术后与术前外周血CK20 mRNA阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
2.2 腔镜组不同TNM分期患者手术前后外周血CK20 mRNA的OD值比较 手术前腔镜组39例CK20 mRNA阳性者中，Ⅰ期8例、Ⅱ期12例、Ⅲ期19例；手术后42例CK20 mRNA阳性者中，Ⅰ期
9例、Ⅱ期14例、Ⅲ期19例。腔镜组Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ期患者术后外周血CK20 mRNA的OD值与术前比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；术前和术后，Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ期CK20 mRNA的OD值均依次递增，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
3 讨论
微转移是指以常规手段很难检测出来的恶性肿瘤转移灶，通常是直径都不到2 mm[2]。文献[3]研究表明，微转移对恶性肿瘤术后的复发与预后具有重要意义。与大体肿瘤最大的不同在于微转移灶缺乏血液供应，因而微转移的肿瘤细胞可以长期处于休眠状态，仅依靠渗透作用摄取养分，直至肿瘤细胞被免疫监控识别清除或逃避监控获得肿瘤滋养血管的血供开始生长[4]。尽管近年来腹腔镜手术有了较大的发展，但是这种手术方式对于直肠癌根治的效果和安全性却一直都存在争议。是否会因术中的创伤、炎症等因素导致微转移灶的肿瘤细胞逃避免疫监视而获得滋养血供，目前不得而知。
CK20本身就是较为敏感的检测血液中肿瘤细胞的标记物，经RT-PCR反应后能够在106～107个正常细胞中检出一个肿瘤细胞[5-10]，因此以CK20 mRNA作为恶性肿瘤微转移灶的检测手段具有较高的准确性和可靠性。
腹腔镜手术与开腹手术最大的区别在于操作空间和视野。腹腔镜手术的所有操作均是建立在CO2气腹下，目前尚未见CO2气腹可以促进肿瘤细胞扩散、转移的报道；手术中的影像系统在放大视野后使医生的操作更加精细，对组织的刺激更小；而超声刀对组织的及时凝固也降低了肿瘤散播的机会。本研究结果显示，两组术前及术后的CK20 mRNA阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），说明腹腔镜手术并不造成直肠癌根治患者的术中微转移。
有学者认为，直肠癌微转移程度与其分期具有一定的关系[11-18]。本研究也发现，腔镜组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者术后外周血CK20 mRNA的OD值与术前比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；术前和术后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期CK20 mRNA的OD值均依次递增（P<0.05），也说明肿瘤细胞的微转移随着直肠癌的进展越来越多。
综上所述，本研究并未发现腹腔镜手术能增加进展期直肠癌的微转移风险，其微转移的数量只与肿瘤的进展程度有关。
参考文献
[1]段金雨，刘春雷，贾宝洋，等.大肠癌淋巴结微转移检测的研究进展[J].世界华人消化杂志，2017，25（3）：261-266.
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[3]牛文博，丁瑞，周朝熙，等.直肠癌淋巴结微转移与预后关系[J].医学信息，2014，28（16）：156.
[4]周淑敏.淋巴结微转移检测对结直肠癌病理分期的影响[J].中国药物经济学，2014，22（z2）：123-124.
[5]孙立辉，王大巍，樊毅.联合检测外周血及腹水中CK20水平对结直肠癌微转移的意义[J].辽宁医学院学报，2014，35（4）：30-32.
[6]周坤，葛海燕.腹腔镜结直肠癌根治术对肿瘤细胞微转移影响的研究[J].中国普通外科杂志，2005，14（12）：896-899.
[7]董纯秀，彭波，刘月，等.腹腔镜结直肠癌根治术对血循环微转移影响的研究[J].重庆医学，2010，39（9）：1056-1058.
[8]肖毅，劉森林，刘沛华，等.腹腔镜结直肠癌根治术对肿瘤细胞血循环微转移的影响[J].齐齐哈尔医学院学报，2015，4（21）：3123-3125.
[9]江少锋.GCC mRNA、hTERT mRNA联合检测开腹和腹腔镜结直肠癌根治术对血循环微转移影响的临床研究[D].长沙：中南大学，2012.
[10]胡德升.腹腔镜结直肠癌根治术对肿瘤细胞血循环微转移的研究[D].郑州：郑州大学，2010.
[11]程明荣，徐宏智，蔡元坤.淋巴结微转移对结直肠癌患者预后的影响[J].中华消化外科杂志，2009，8（5）：380-382.
[12]秦章禄，郭朝阳，周兴舰，等.不同气腹压腹腔镜技术对结直肠癌外周血微转移的影响[J].江西医药，2016，51（5）：388-390.
[13]郭朝阳，秦章禄，袁庆文，等.腹腔镜技术对结直肠癌淋巴结微转移的影响[J].实用临床医学，2015，5（3）：36-37.
[14]陈绍勤，支宇，曹永晋，等.5-FU门静脉插管化疗对结直肠癌血液微转移的影响[J].现代肿瘤医学，2008，16（4）：611-613.
[15]徐建，张晨晖，刘忠诚，等.腹腔镜直肠癌根治术117例报告[J].中国微创外科杂志，2009，9（1）：15-17.
[16]宋玉成，张广坛，宋笑飞，等.纳米炭在腹腔镜中下段直肠癌根治术中的临床应用[J].山东医药，2011，51（52）：76-77.
[17]罗运生，夏涛，李威.腹腔镜辅助行Ⅱ|Ⅲ期胃癌根治术临床分析[J].中国普通外科杂志，2013，22（4）：509-511.
[18]李敬，王卫，赵启军，等.腹腔镜结直肠癌根治术的疗效分析[J].内蒙古医学杂志，2012，5（S3）：17-19.
（收稿日期：2017-06-16） （本文编辑：邓朝阳）
4月-2017年4月本院普外科收治的160例进展期直肠癌患者作为研究对象，按照手术方式分为腔镜组与开腹组，各80例。采用RT-PCR方法检测所有入选者术前和术后外周血的CK20 mRNA，对其进行定性检测和定量检测。比较手术前后两组外周血CK20 mRNA阳性率，比较腔镜组不同TNM分期患者手术前后外周血CK20 mRNA的OD值。结果：两组术前及术后CK20 mRNA阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。腔镜组Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ期患者术后外周血CK20 mRNA的OD值与术前比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；术前和术后，Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ期CK20 mRNA的OD值均依次递增（P<0.05）。结论：腹腔镜手术并不增加进展期直肠癌的微转移风险，微转移的数量只与肿瘤的进展程度有关。
【关键词】 腹腔镜； 直肠癌根治术； 进展期直肠癌； 微转移
【Abstract】 Objective：To investigate the effect of laparoscopic radical resection of rectal cancer on micrometastasis in patients with advanced rectal cancer.Method：A total of 160 patients with advanced rectal cancer were enrolled in this study from April 2013 to April 2017 in our hospital and they were divided into laparoscopic group and laparotomy group according to the surgical method， 80 cases in each group.RT-PCR was used to detect CK20 mRNA in preoperative and postoperative peripheral blood samples with qualitative and quantitative detection.The positive rate of CK20 mRNA in the peripheral blood of two groups was compared，the OD value of the CK20 mRNA in the peripheral blood of patients with different TNM staging in laparoscopic group were compared.Result：There were no statistical significances in the positive rate of CK20 mRNA of two groups before and after operation（P>0.05）.Compared before and after operation，there were no statistical significances in the OD value of CK20 mRNA in peripheral blood of patients with stageⅠ，Ⅱ and Ⅲ in laparoscopic group（P>0.05）；but preoperative and postoperative，the OD value of CK20 mRNA in stage Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ were gradually increased（P<0.05）.Conclusion：Laparoscopic surgery can not increase the risk of micrometastasis in advanced rectal cancer，the number of micrometastases is only related to the degree of tumor progression.
【Key words】 Laparoscopy； Rectal cancer radical surgery； Advanced rectal cancer； Micrometastasis
First-author’s address：The Shawan People’s Hospital in Panyu District of Guangzhou City，Guangzhou 511400，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.21.039
微轉移通常是指隐性转移，大多数转移灶都是由微转移发展而来[1]。近年来，越来越多的胃肠肿瘤手术在腹腔镜下开展，因此腔镜下直肠癌根治术是否会对进展期直肠癌患者的微转移产生影响开始受到临床医生的关注。本研究以本院普外科160例进展期直肠癌患者作为研究对象，用CK20作为血液微转移的标记物，对上述问题进行讨论，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2013年4月-2017年4月本院普外科收治的160例进展期直肠癌患者作为研究对象，按照手术方式分为腔镜组与开腹组，各80例。入选标准：（1）术前经直肠镜、病理检查确诊为直肠癌；（2）术前经影像学检查确定TNM分期为Ⅰ～Ⅲ期；（3）术前评估ASA≤3分。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）接受过放、化疗；（3）既往有其他腹部手术史；（4）术前TNM分期为Ⅳ期。腔镜组中，男42例，女38例，年龄37～73岁，平均（58.64±6.59）岁，Ⅰ期9例，Ⅱ期45例，Ⅲ期26例；开腹组中，男45例，女35例，年龄39～77岁，平均（59.13±6.74）岁，Ⅰ期12例，Ⅱ期47例，Ⅲ期21例。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 方法
1.2.1 手术原则 严格遵循直肠癌根治原则和手术无瘤原则，所有入选病例的手术过程均由同一组医师实施。
1.2.2 标本采集 所有患者手术前1 d于清晨空腹状态下采集肘静脉血5 mL，腔镜组在气腹结束后采集肘静脉血5 mL，开腹组在手术后立即采集肘静脉血5 mL。EDTA抗凝，离心去上清后-80 ℃冰箱保存。
1.2.3 CK20 mRNA检测 RT-PCR方法检测，步骤如下：（1）单核细胞分离：标本解冻，取2.5 mL后置于无菌管中，加入Tris 250 μL，12 000 r/min离心5 min后去上清，沉淀物加入PBS缓冲液500 μL悬浮，继续12 000 r/min离心5 min后去上清；（2）提取RNA：加入RNA提取液，75%乙醇200 μL漂洗，离心后吸干，无水酶溶解RNA；（3）RT-PCR反应：70 ℃预变性5 min，冰浴防止复性，取RT反应液18 μL、逆转录酶1 μL、RNasin 1 μL加入无菌离心管并混匀，在每个反应管中加入20 μL上述反应液和预变性的RNA 5 μL，37 ℃水浴30 min；（4）PCR扩增：取PCR反应液43 μL、Taq酶2 μL置于无菌离心管混匀，加入RT-PCR反应产物进行扩增，按变性、退火、延伸的步骤35个循环，最终于4 ℃保存。
1.2.4 产物分析 （1）定性分析：将产物以2%琼脂糖凝胶电泳，紫外成像仪下观察，于370 bp处呈清晰条带状者即为阳性，反之为阴性；（2）定量分析：取阳性产物，采用图像分析仪器测定其光密度OD值，分析其产物量。
1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组手术前后外周血CK20 mRNA阳性率比较 两组术前及术后CK20 mRNA阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；腔镜组术后与术前外周血CK20 mRNA阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；开腹组术后与术前外周血CK20 mRNA阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
2.2 腔镜组不同TNM分期患者手术前后外周血CK20 mRNA的OD值比较 手术前腔镜组39例CK20 mRNA阳性者中，Ⅰ期8例、Ⅱ期12例、Ⅲ期19例；手术后42例CK20 mRNA阳性者中，Ⅰ期
9例、Ⅱ期14例、Ⅲ期19例。腔镜组Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ期患者术后外周血CK20 mRNA的OD值与术前比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；术前和术后，Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ期CK20 mRNA的OD值均依次递增，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
3 讨论
微转移是指以常规手段很难检测出来的恶性肿瘤转移灶，通常是直径都不到2 mm[2]。文献[3]研究表明，微转移对恶性肿瘤术后的复发与预后具有重要意义。与大体肿瘤最大的不同在于微转移灶缺乏血液供应，因而微转移的肿瘤细胞可以长期处于休眠状态，仅依靠渗透作用摄取养分，直至肿瘤细胞被免疫监控识别清除或逃避监控获得肿瘤滋养血管的血供开始生长[4]。尽管近年来腹腔镜手术有了较大的发展，但是这种手术方式对于直肠癌根治的效果和安全性却一直都存在争议。是否会因术中的创伤、炎症等因素导致微转移灶的肿瘤细胞逃避免疫监视而获得滋养血供，目前不得而知。
CK20本身就是较为敏感的检测血液中肿瘤细胞的标记物，经RT-PCR反应后能够在106～107个正常细胞中检出一个肿瘤细胞[5-10]，因此以CK20 mRNA作为恶性肿瘤微转移灶的检测手段具有较高的准确性和可靠性。
腹腔镜手术与开腹手术最大的区别在于操作空间和视野。腹腔镜手术的所有操作均是建立在CO2气腹下，目前尚未见CO2气腹可以促进肿瘤细胞扩散、转移的报道；手术中的影像系统在放大视野后使医生的操作更加精细，对组织的刺激更小；而超声刀对组织的及时凝固也降低了肿瘤散播的机会。本研究结果显示，两组术前及术后的CK20 mRNA阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），说明腹腔镜手术并不造成直肠癌根治患者的术中微转移。
有学者认为，直肠癌微转移程度与其分期具有一定的关系[11-18]。本研究也发现，腔镜组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者术后外周血CK20 mRNA的OD值与术前比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；术前和术后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期CK20 mRNA的OD值均依次递增（P<0.05），也说明肿瘤细胞的微转移随着直肠癌的进展越来越多。
综上所述，本研究并未发现腹腔镜手术能增加进展期直肠癌的微转移风险，其微转移的数量只与肿瘤的进展程度有关。
参考文献
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（收稿日期：2017-06-16） （本文编辑：邓朝阳）