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摘要：目的：探讨HIF-1α（低氧诱导因子-1α）和PTEN（第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因）在骨肉瘤中的表达及应用价值。方法：选取我院在2012年4月~2014年4月行手术切除术的28例骨肉瘤患者作为研究组，另选取同期收治的30例行手术治疗的软骨瘤患者作为对照组，取两组手术切除的骨肉瘤标本和软骨瘤标本进行HIF-1α和PTEN检测，对两组检测结果进行对比、分析。结果：研究组的HIF-1α阳性检出率显著高于对照组，PTEN阳性检出率显著低于对照组（P<0.05）。在不同年龄、性别、肿瘤直径、Dahilin分型的骨肉瘤患者中，HIF-1α与PTEN表达均无显著性差异，P>0.05；不同病理分级、Enneking病理分期的骨肉瘤患者，HIF-1α阳性率比较具有显著性差异（P<0.05）；肺转移者的HIF-1α阳性率显著高于无肺转移者，PTEN阳性率则显著低于无肺转移者，P<0.05，差异均具有统计学意义。经相关性检验，证实HIF-1α与PTEN呈负相关（P<0.05，r=-0.449）。结论：骨肉瘤与PTEN、HIF-1α表达均有着密切关系，且PTEN与HIF-1α表达呈负相关，即PTEN表达越高，HIF-1α表达就越低。联合检测PTEN、HIF-1α表达，对于早期诊断骨肉瘤，评估患者预后具有重大意义。
关键词：PTEN；HIF-1α；骨肉瘤；免疫组化分析
骨肉瘤是一种临床发病率较高的恶性骨肿瘤，在骨肿瘤中，骨肉瘤的发病率高达20%，而且在恶性骨肿瘤中，有超过76%的都为骨肉瘤[1]。本病多发于青少年人群，发病早期容易转移到肺部，而且病情进展快、预后效果差，会给患者的身体健康、生命安全产生极大的威胁。目前，关于骨肉瘤的发病机制还没有完全明确的阐释。既往研究已经证实，HIF-1α（低氧诱导因子-1α）和PTEN（第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因）与某些恶性肿瘤的发生、发展有一定联系，但关于者二者与骨肉瘤的相关性研究则十分鲜见[2]。本研究为探明HIF-1α、PTEN与骨肉瘤的相关性，对骨肉瘤及软骨瘤标本进行了PTEN、HIF-1α检测，现报道如下。
1 一般资料与方法
1.1 一般资料
选取我院在2012年4月~2014年4月行手术切除术的28例骨肉瘤患者作为研究组，所有患者均经病理检查明确诊断为骨肉瘤，且术前未进行过放化疗。其中男17例，女11例，年龄9~64岁，平均（25.1±3.6）岁。Dahlin组织学分型显示，6例为软骨母细胞瘤，8例为纤维母细胞瘤，11例为骨母细胞瘤，3例为其他类型。Enneking病理分期：Ⅰ期2例，Ⅱa期7例，Ⅱb期14例，Ⅲ期5例。其中8例为高分化癌，12例为中分化癌，8例为低分化癌。另选取同期在我院行手术切除术的30例软骨瘤患者作为对照组，本组患者均经病理检查确诊，男20例，女10例，年龄12~71岁，平均（30.8±3.9）岁。两组患者的年龄、性别比较，无显著性差异（P>0.05），有可比性。
1.2 方法
1.2.1 标本制作
取两组患者手术切除的骨肉瘤组织和软骨瘤组织，脱钙处理后，以甲醛（4%）固定24小时，然后进行石蜡包埋，再连续切片，厚度4μm。预先使用多聚赖氨酸（1%）对载玻片进行处理，然后将组织切片贴附在载玻片上，并将载玻片置于65℃环境中烤片，1.5小时后取出备检。
1.2.2 试剂
DAB显色试剂盒，SP免疫组织化学试剂盒，鼠抗人PTEN单克隆抗体，鼠抗人HIF-1α单克隆抗体。所有试剂盒及抗体均由武汉博士德生物技术有限公司提供。
1.2.3 检测方法
PTEN、HIF-1α檢验均采用DAB染色、免疫组化SP法。阳性对照选用已证实的阳性切片，阴性对照选用PBS代替一抗。
1.3 结果评定
在每张切片中随机选取细胞数≥50的高倍视野10个，观察肿瘤细胞显色颗粒的着色情况，若着色程度比背景染色更高，则判定为阳性染色。根据阳性细胞数在同类计数细胞中的占比，进行染色分级。HIF-1α、PTEN表达分别位于细胞核和细胞质中，二者的阳性细胞均呈棕黄色。染色较淡，阳性细胞占比不足25%，判定为阴性（-）；染色清晰，阳性细胞占比在25~50%之间，判定为阳性（+）；染色强烈，阳性细胞占比超过50%，判定为强阳性（++）。
1.4 统计学方法
本次研究数据均使用统计学软件SPSS18.0进行处理、分析，计量资料以 表示，数据比较采用t检验，计数资料比较采用x2检验，并对HIF-1α、PTEN表达进行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 骨肉瘤和软骨瘤中的HIF-1α、PTEN表达
研究组的HIF-1α阳性检出率为53.6%，显著高于对照组（0.0%），P<0.05，差异具有统计学意义；对照组的PTEN阳性检出率为93.3%，研究组为57.1%，组间比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。详见表1。
表1两组患者的HIF-1α、PTEN阳性检出率比较[n（%）]
组别（n） HIF-1α阳性 PTEN阳性
研究组（28）
对照组（30） 15（53.6）
0（0.0） 16（57.1）
28（93.3）
2.2 骨肉瘤HIF-1α、PTEN与病理特征关系
研究组病理特征与HIF-1α、PTEN表达关系详见表2。从表2可知，在不同年龄、性别、肿瘤直径、Dahilin分型的骨肉瘤患者中，HIF-1α与PTEN表达均无显著性差异，P>0.05；在Enneking病理分期方面，Ⅱb-Ⅲ期患者的HIF-1α阳性率显著高于Ⅰ-Ⅱa者，P<0.05，差异具有统计学意义；不同病理分级的骨肉瘤患者，其HIF-1α阳性率比较具有显著性差异（P<0.05）；低分化者的HIF-1α阳性率显著高于中分化和高分化者，P<0.05；在不同病理分级及Enneking病理分期患者中，PTEN阳性率比较，均无显著性差异（P>0.05）；肺转移者的HIF-1α阳性率显著高于无肺转移者，PTEN阳性率则显著低于无肺转移者，P<0.05，差异均具有统计学意义。
表2研究组病理特征与HIF-1α、PTEN表达的关系
病理特征 例数 PTEN P HIF-1α P
- +~++ 阳性率
（%） - +~++ 阳性率
（%）
年龄
<24.5岁
≥24.5岁
性别
男
女
肿瘤直径
≥5cm
<5cm
Dahlin分型
软骨母细胞
纤维母细胞
骨母细胞
其他
病理分级
低分化
中分化
高分化
病理分期
Ⅰ-Ⅱa
Ⅱb-Ⅲ
肺转移
有
无
10
18
17
11
16
12
6
8
11
3
8
12
8
9
19
20
8
4
8
6
6
7
5
3
3
5
1
4
5
3
4
8
11
1
6
10
11
5
9
7
3
5
6
2
4
7
5
5
11
9
7
60.0
61.1
64.7
45.5
56.3
58.3
50.0
62.5
54.5
66.7
50.0
58.3
62.5
55.6
57.9
45.0
87.5 >0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
<0.05
5
8
7
7
8
5
2
4
6
1
1
6
6
7
6
7
6 15
5
10
10
5
8
7
4
4
5
2
7
6
2
2
13
13
2
50.0
61.0
58.8
45.5
50.0
58.3
66.7
50.0
45.5
66.7
87.5
50.0
25.0
22.2
68.4
65.0
25.0 >0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
<0.05
<0.05
2.3 骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表達相关性
骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表达相关性，详见表3。从表3可知，在骨肉瘤组织中，PTEN表达越高，HIF-1α表达越低，HIF-1α随着PTEN表达的升高而降低，经相关性检验，证实HIF-1α与PTEN呈负相关（P<0.05，r=-0.449）。
表3骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表达相关性
PTEN 例数 HIF-1α
阳性（+~++） 阴性（-）
阳性（+~++）
阴性（-）
合计 16
12
28 3
12
15 13
0
13
3 讨论
HIF-1是一种可与DNA特异序列、促红细胞生成因子基因结合的蛋白质，其由α、β两个亚单位组成[3]。HIF-1α主要负责调节HIF-1活性，其会广泛参与哺乳动物细胞缺氧诱导产生的特异应答。既往有研究显示[4]，人体大部分肿瘤组织中都有着高水平的HIF-1α表达，而且缺氧肿瘤组织中的HIF-1α表达更高，研究还显示HIF-1α表达与病人的预后有着密切联系。在癌细胞发展过程中，肿瘤比血管生长更快，所以会导致局部缺氧，触发HIF-1α表达。另外，还有研究显示[5]，VSPC等癌基因的激活，PTEN等抑癌基因的突变也可触发HIF-1α表达，并且此时的HIF-1α表达不会对氧浓度产生依赖。
HIF-1α高表达会激活肿瘤相关血管生成、糖代谢、肿瘤转移、细胞增殖等靶基因功能，具体包括[6]：增强糖酵解能力；促使肿瘤细胞增殖；加快肿瘤血管生成；提高EPO水平。这些功能的激活会改善肿瘤组织的氧供及血供，从而促进肿瘤加速生长。据国外文献研究显示，在对上皮性卵巢癌、卵巢囊腺瘤标本进行检测发现，有超过68%的上皮性卵巢癌标本的HIF-1α都呈高表达，而且肿瘤转移者的HIF-1α阳性率明显比无转移者更高，但在卵巢囊腺瘤标本中，则未检出HIF-1α表达[7]。在本次研究中，对骨肉瘤和软骨瘤标本进行检测发现，研究组（骨肉瘤）的HIF-1α阳性检出率显著高于对照组（软骨瘤），PTEN阳性检出率显著低于对照组（P<0.05）。这一结果与前述文献报道相符。本次研究结果还显示：在不同Enneking病理分期及病理分级患者中，HIF-1α阳性率比较均有显著性差异（P<0.05），而且肺转移者的HIF-1α阳性率显著高于无肺转移者（P<0.05）。这表明HIF-1α与骨肉瘤的发生、发展可能有着密切关系，其可作为骨肉瘤预后判断及早期诊断的有效指标[8]。
PTEN是一种抑癌基因，其具有双重特异性磷酸酶活性，其能对磷酸化的酸酸、丝氨酸、酪氨酸发挥去磷酸化作用，从而对癌细胞产生抑制作用[9]。目前已有研究证实[10]，PTEN在甲状腺癌、前列腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤组织中的表达水平较低，这可能与PTEN基因突变或缺失有关。在PTEN发生突变或缺失后，会降低其磷酸酶活性，从而强化肿瘤细胞的增殖能力。本次研究结果显示，骨肉瘤组织中的PTEN表达显著低于软骨瘤组织，P<0.05；并且骨肉瘤组织中的PTEN阳性表达与病理分级、病理分期均无相关性，说明PTEN基因缺失会对骨肉瘤发生、发展的整个过程产生影响。本次研究结果还显示，骨肉瘤组织中的PTEN与HIF-1α表达呈负相关，表明PTEN基因失活会促使HIF-1α表达，使肿瘤发展进程加快。
综上所述，骨肉瘤与PTEN、HIF-1α表达均有着密切关系，且PTEN与HIF-1α表达呈负相关，即PTEN表达越高，HIF-1α表达就越低。联合检测PTEN、HIF-1α表达，对于早期诊断骨肉瘤，评估患者预后具有重大意义。
参考文献：
[1] 陈勇，王春萌，师英强等.骨肉瘤组织中缺氧诱导因子1α的表达及其预测骨肉瘤化疗敏感性的价值[J].中华肿瘤杂志，2012，34（12）：899-904.
[2] 秦刚，李海东，徐苏洋等.蜂毒素对荷骨肉瘤裸鼠体瘤内皮祖细胞数量和细胞因子HIF-1α及SDF-1α的影响[J].广东医学，2013，34（21）：3226-3229.
[3] 杜鑫辉，董扬，杨庆诚等.HIF-1α和Cox-2在骨肉瘤细胞中的表达及与临床预后的相关性分析[J].中国骨与关节杂志，2012，01（2）：156-159.
[4] 鲍正齐，柴大敏，肖玉周等.骨肉瘤中血管生成拟态与HIF-1α蛋白的关系及临床意义[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2013，22（3）：241-248.
[5] 雷雷，吕智，韩鹏飞等.PTEN与MMP-9在骨肉瘤中的表达和临床意义[J].山西医科大学学报，2009，40（3）：219-221，287.
[6] 蒋正辉，张维康，邵金祥等.Skp2、p27和PTEN在骨肉瘤中表达及调控[J].临床骨科杂志，2012，15（3）：339-342.
[7] 黄山，黄帆，遇呈祥等.老年骨肉瘤患者术后组织中VEGF、WTX和PTEN的表达及意义[J].中国老年学杂志，2013，33（11）：2660-2661.
[8] 徐生林，胡勇，金问森等.PTEN基因真核表达载体的构建及在MG63中表达[J].安徽医科大学学报，2012，47（7）：789-792.
[9] 韩鹏飞，吕智，刘小丽等.抑癌基因PTEN和p27在骨肉瘤组织中的表达及其临床意义[J].山西医科大学学报，2009，40（3）：221-224，288.
[10] 廖前德，陈刚，钟达等.骨肉瘤中PTEN蛋白的表达与微血管密度相关性研究[J].医学临床研究，2009，26（11）：2009-2012.
关键词：PTEN；HIF-1α；骨肉瘤；免疫组化分析
骨肉瘤是一种临床发病率较高的恶性骨肿瘤，在骨肿瘤中，骨肉瘤的发病率高达20%，而且在恶性骨肿瘤中，有超过76%的都为骨肉瘤[1]。本病多发于青少年人群，发病早期容易转移到肺部，而且病情进展快、预后效果差，会给患者的身体健康、生命安全产生极大的威胁。目前，关于骨肉瘤的发病机制还没有完全明确的阐释。既往研究已经证实，HIF-1α（低氧诱导因子-1α）和PTEN（第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因）与某些恶性肿瘤的发生、发展有一定联系，但关于者二者与骨肉瘤的相关性研究则十分鲜见[2]。本研究为探明HIF-1α、PTEN与骨肉瘤的相关性，对骨肉瘤及软骨瘤标本进行了PTEN、HIF-1α检测，现报道如下。
1 一般资料与方法
1.1 一般资料
选取我院在2012年4月~2014年4月行手术切除术的28例骨肉瘤患者作为研究组，所有患者均经病理检查明确诊断为骨肉瘤，且术前未进行过放化疗。其中男17例，女11例，年龄9~64岁，平均（25.1±3.6）岁。Dahlin组织学分型显示，6例为软骨母细胞瘤，8例为纤维母细胞瘤，11例为骨母细胞瘤，3例为其他类型。Enneking病理分期：Ⅰ期2例，Ⅱa期7例，Ⅱb期14例，Ⅲ期5例。其中8例为高分化癌，12例为中分化癌，8例为低分化癌。另选取同期在我院行手术切除术的30例软骨瘤患者作为对照组，本组患者均经病理检查确诊，男20例，女10例，年龄12~71岁，平均（30.8±3.9）岁。两组患者的年龄、性别比较，无显著性差异（P>0.05），有可比性。
1.2 方法
1.2.1 标本制作
取两组患者手术切除的骨肉瘤组织和软骨瘤组织，脱钙处理后，以甲醛（4%）固定24小时，然后进行石蜡包埋，再连续切片，厚度4μm。预先使用多聚赖氨酸（1%）对载玻片进行处理，然后将组织切片贴附在载玻片上，并将载玻片置于65℃环境中烤片，1.5小时后取出备检。
1.2.2 试剂
DAB显色试剂盒，SP免疫组织化学试剂盒，鼠抗人PTEN单克隆抗体，鼠抗人HIF-1α单克隆抗体。所有试剂盒及抗体均由武汉博士德生物技术有限公司提供。
1.2.3 检测方法
PTEN、HIF-1α檢验均采用DAB染色、免疫组化SP法。阳性对照选用已证实的阳性切片，阴性对照选用PBS代替一抗。
1.3 结果评定
在每张切片中随机选取细胞数≥50的高倍视野10个，观察肿瘤细胞显色颗粒的着色情况，若着色程度比背景染色更高，则判定为阳性染色。根据阳性细胞数在同类计数细胞中的占比，进行染色分级。HIF-1α、PTEN表达分别位于细胞核和细胞质中，二者的阳性细胞均呈棕黄色。染色较淡，阳性细胞占比不足25%，判定为阴性（-）；染色清晰，阳性细胞占比在25~50%之间，判定为阳性（+）；染色强烈，阳性细胞占比超过50%，判定为强阳性（++）。
1.4 统计学方法
本次研究数据均使用统计学软件SPSS18.0进行处理、分析，计量资料以 表示，数据比较采用t检验，计数资料比较采用x2检验，并对HIF-1α、PTEN表达进行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 骨肉瘤和软骨瘤中的HIF-1α、PTEN表达
研究组的HIF-1α阳性检出率为53.6%，显著高于对照组（0.0%），P<0.05，差异具有统计学意义；对照组的PTEN阳性检出率为93.3%，研究组为57.1%，组间比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。详见表1。
表1两组患者的HIF-1α、PTEN阳性检出率比较[n（%）]
组别（n） HIF-1α阳性 PTEN阳性
研究组（28）
对照组（30） 15（53.6）
0（0.0） 16（57.1）
28（93.3）
2.2 骨肉瘤HIF-1α、PTEN与病理特征关系
研究组病理特征与HIF-1α、PTEN表达关系详见表2。从表2可知，在不同年龄、性别、肿瘤直径、Dahilin分型的骨肉瘤患者中，HIF-1α与PTEN表达均无显著性差异，P>0.05；在Enneking病理分期方面，Ⅱb-Ⅲ期患者的HIF-1α阳性率显著高于Ⅰ-Ⅱa者，P<0.05，差异具有统计学意义；不同病理分级的骨肉瘤患者，其HIF-1α阳性率比较具有显著性差异（P<0.05）；低分化者的HIF-1α阳性率显著高于中分化和高分化者，P<0.05；在不同病理分级及Enneking病理分期患者中，PTEN阳性率比较，均无显著性差异（P>0.05）；肺转移者的HIF-1α阳性率显著高于无肺转移者，PTEN阳性率则显著低于无肺转移者，P<0.05，差异均具有统计学意义。
表2研究组病理特征与HIF-1α、PTEN表达的关系
病理特征 例数 PTEN P HIF-1α P
- +~++ 阳性率
（%） - +~++ 阳性率
（%）
年龄
<24.5岁
≥24.5岁
性别
男
女
肿瘤直径
≥5cm
<5cm
Dahlin分型
软骨母细胞
纤维母细胞
骨母细胞
其他
病理分级
低分化
中分化
高分化
病理分期
Ⅰ-Ⅱa
Ⅱb-Ⅲ
肺转移
有
无
10
18
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55.6
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2.3 骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表達相关性
骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表达相关性，详见表3。从表3可知，在骨肉瘤组织中，PTEN表达越高，HIF-1α表达越低，HIF-1α随着PTEN表达的升高而降低，经相关性检验，证实HIF-1α与PTEN呈负相关（P<0.05，r=-0.449）。
表3骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表达相关性
PTEN 例数 HIF-1α
阳性（+~++） 阴性（-）
阳性（+~++）
阴性（-）
合计 16
12
28 3
12
15 13
0
13
3 讨论
HIF-1是一种可与DNA特异序列、促红细胞生成因子基因结合的蛋白质，其由α、β两个亚单位组成[3]。HIF-1α主要负责调节HIF-1活性，其会广泛参与哺乳动物细胞缺氧诱导产生的特异应答。既往有研究显示[4]，人体大部分肿瘤组织中都有着高水平的HIF-1α表达，而且缺氧肿瘤组织中的HIF-1α表达更高，研究还显示HIF-1α表达与病人的预后有着密切联系。在癌细胞发展过程中，肿瘤比血管生长更快，所以会导致局部缺氧，触发HIF-1α表达。另外，还有研究显示[5]，VSPC等癌基因的激活，PTEN等抑癌基因的突变也可触发HIF-1α表达，并且此时的HIF-1α表达不会对氧浓度产生依赖。
HIF-1α高表达会激活肿瘤相关血管生成、糖代谢、肿瘤转移、细胞增殖等靶基因功能，具体包括[6]：增强糖酵解能力；促使肿瘤细胞增殖；加快肿瘤血管生成；提高EPO水平。这些功能的激活会改善肿瘤组织的氧供及血供，从而促进肿瘤加速生长。据国外文献研究显示，在对上皮性卵巢癌、卵巢囊腺瘤标本进行检测发现，有超过68%的上皮性卵巢癌标本的HIF-1α都呈高表达，而且肿瘤转移者的HIF-1α阳性率明显比无转移者更高，但在卵巢囊腺瘤标本中，则未检出HIF-1α表达[7]。在本次研究中，对骨肉瘤和软骨瘤标本进行检测发现，研究组（骨肉瘤）的HIF-1α阳性检出率显著高于对照组（软骨瘤），PTEN阳性检出率显著低于对照组（P<0.05）。这一结果与前述文献报道相符。本次研究结果还显示：在不同Enneking病理分期及病理分级患者中，HIF-1α阳性率比较均有显著性差异（P<0.05），而且肺转移者的HIF-1α阳性率显著高于无肺转移者（P<0.05）。这表明HIF-1α与骨肉瘤的发生、发展可能有着密切关系，其可作为骨肉瘤预后判断及早期诊断的有效指标[8]。
PTEN是一种抑癌基因，其具有双重特异性磷酸酶活性，其能对磷酸化的酸酸、丝氨酸、酪氨酸发挥去磷酸化作用，从而对癌细胞产生抑制作用[9]。目前已有研究证实[10]，PTEN在甲状腺癌、前列腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤组织中的表达水平较低，这可能与PTEN基因突变或缺失有关。在PTEN发生突变或缺失后，会降低其磷酸酶活性，从而强化肿瘤细胞的增殖能力。本次研究结果显示，骨肉瘤组织中的PTEN表达显著低于软骨瘤组织，P<0.05；并且骨肉瘤组织中的PTEN阳性表达与病理分级、病理分期均无相关性，说明PTEN基因缺失会对骨肉瘤发生、发展的整个过程产生影响。本次研究结果还显示，骨肉瘤组织中的PTEN与HIF-1α表达呈负相关，表明PTEN基因失活会促使HIF-1α表达，使肿瘤发展进程加快。
综上所述，骨肉瘤与PTEN、HIF-1α表达均有着密切关系，且PTEN与HIF-1α表达呈负相关，即PTEN表达越高，HIF-1α表达就越低。联合检测PTEN、HIF-1α表达，对于早期诊断骨肉瘤，评估患者预后具有重大意义。
参考文献：
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