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摘要：目的 观察中药延胡索主要有效成分脱氢紫堇碱（DHC）对高浓度葡萄糖培养的心肌成纤维细胞（CFs）增殖和胶原分泌的影响，为延胡索的临床应用提供实验依据。方法 采用体外高糖培养的CFs模型进行实验。以胶原酶与胰蛋白酶联合消化分离出生24 h内乳鼠CFs，取2～4代细胞高浓度葡萄糖（25 mmol/L）培养，分别加入100、50、25 mg/L DHC干预，24、48 h后镜下观察细胞形态，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期，ELISA测定Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量。结果 CFs种植3 h后开始贴壁生长，高浓度葡萄糖培养液培养24、48 h后细胞增殖明显增加（P<0.05，P<0.01），48 h后S+G2+M期细胞的百分率明显增加（P<0.01），细胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原量明显升高（P<0.01）；DHC干预后可显著抑制CFs增殖（P<0.01），降低S+G2+M期细胞百分率（P<0.01），减少Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌（P<0.05，P<0.01）。结论 DHC能抑制高糖培养的CFs的增殖，减少胶原分泌，DHC具有潜在的抗心肌纤维化作用。
关键词：脱氢紫堇碱；体外高糖培养；心肌成纤维细胞；细胞增殖；胶原
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）10-0050-04
Abstract：Objective To observe the effects of dehydrocorydaline （DHC） on proliferation and collagen secretion of cardiac fibroblasts （CFs） cultured by high glucose；To provide experimental evidence for clinical application of Rhizoma Corydalis. Methods CFs cultured in vitro with high glucose were made into models. Collagenase and trypsin were used for the combine digestion of CFs from ratsbornin 24 h. 2-4 generation CFs were cultured by high glucose （25 mmol/L）， and then 100， 50， 25 mg/L dethydrocorydaline was added for intervention. Cellular morphology of CFs was observed after 24， 48 h. CFs proliferation was detected by MTT method. Cell cycle was assessed via flow cytometry. The levels of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ were determined by ELISA. Results CFs began to grow adherence 3 hours after planting， and CFs cultured by high glucose significantly proliferated 24， 48 h later （P<0.05， P<0.01）. The percentage of S+G2+M phase CFs increased significantly after 48 h （P<0.01）. The secretion of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ also increased significantly （P<0.01）. After the intervention of DHC， CFs proliferation was significantly inhibited （P<0.01）；the percentage of S+G2+M phase CFs decreased （P<0.01）；the secretion of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ was reduced （P<0.05， P<0.01）. Conclusion DHC can reduce CFs proliferation， decrease collagen secretion of CFs cultured by high glucose， and has potential effects of anti-myocardial fibrosis.
Key words：dehydrocorydaline；cultured in vitro with high glucose；cardiac fibroblasts；cell proliferation；collagen
糖尿病心肌病是一种独立的、特异的糖尿病并发症，临床特征早期以心脏舒张功能不全，晚期以收缩功能不全为主，易并发心力衰竭及心律失常，心肌纤维化是其主要病理特征。心肌成纤维细胞（CFs）的活化、增殖、合成、分泌胶原是糖尿病心肌纤维化产生的主要原因。脱氢紫堇碱（DHC）是延胡索的主要有效成分，药理研究表明，DHC具有扩张冠状动脉、保护心肌缺血再灌注损伤、改善微循环、降低耗氧量、抑制血小板聚集等作用[1-2]，但有关DHC抗心肌纤维化的研究尚未见报道。本实验采用体外高糖培养的CFs模型，初步观察DHC对CFs增殖与胶原分泌的影响，为延胡索的临床应用提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
出生24 h内SD大鼠乳鼠10只，SPF级，雌雄不限，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：11400700012085。 1.2 药物
DHC对照品（北京鑫方程生物公司，批号120930， 20 mg），卡托普利对照品（中国食品药品检定研究院，批号100318-201103，100 mg）。
1.3 主要试剂与仪器
胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、四甲基偶氮唑盐（MTT）均为Sigma公司进口分装产品，DNA PREP试剂盒（库尔特公司），Ⅰ型、Ⅲ型胶原ELISA试剂盒（USCN公司），小鼠抗波形蛋白单克隆抗体和小鼠抗结蛋白单克隆抗体（Biogenes公司），DMEM高糖、低糖培养基和胎牛血清（FCS）均为GIBCO公司产品。流式细胞分析仪（美国BD公司），酶联免疫分析仪（美国BioTek公司）。
2 实验方法
2.1 心肌成纤维细胞培养与鉴定
参照文献[3]方法加以改进。取出生24 h内的SD大鼠乳鼠，在无菌条件下，开胸摘取心脏，置于4 ℃、0.01%磷酸盐缓冲液中，除去红细胞，75%酒精浸泡30 s后剪成1 mm3大小的碎块，弃去0.01%磷酸盐缓冲液，加入等体积的0.125%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶，37 ℃水浴振荡反复消化10 min，至组织块消失，收集每次消化悬液，10%FCS的DMEM低糖培养液终止消化，收集每次消化悬液，2000 r/min离心10 min，弃上清液，再加入10%的DMEM低糖培养液，制成细胞悬液，接种至培养瓶，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养。根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁分离法贴壁60 min，弃上清液，剩下的为CFs，加入含10%FCS的DMEM低糖培养液继续培养。经免疫组化波形蛋白染色阳性和结蛋白染色阴性为所需的CFs，纯度达98%，台盼蓝染色细胞活力>90%。待80%～90%细胞融合后用0.25%胰酶消化传代（1∶2），实验采用2～4代细胞。
2.2 分组与给药
正常组：DMEM低糖培养基（内含5.5 mmol/L D-葡萄糖）；模型组：DMEM高糖培养液（内含25 mmol/L D-葡萄糖）；高渗组：DMEM培养基（含5.5 mmol/L D-葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇）；DHC高、中、低剂量组：100、50、25 mg/L DHC；对照组：22 mg/L卡托普利。
2.3 细胞增殖检测
将处于对数生长期的CFs制成细胞悬液，以5×104个/mL接种于96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后换无血清DMEM继续培养24 h，分别给予不同的处理因素，每组6个复孔，继续培养24、48 h，再在每孔中加入10 μL（1 g/L）MTT溶液，37 ℃，继续培养4 h，终止培养，弃上清液，加入100 μL DMSO/孔，酶标仪490 nm波长测吸光度（A值）。
2.4 心肌成纤维细胞细胞周期检测
取CFs制成细胞悬液，以1×105个/mL接种于96孔板，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，换无血清DMEM继续培养24 h，给予不同的处理因素，每组3个复孔，培养48 h。用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度1×106个/mL，严格按细胞周期试剂盒说明书操作，在流式细胞仪上进行检测，用MCYCLE软件进行细胞周期分析。
2.5 Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量检测
取CFs制成细胞悬液，以1×105个/mL接种于96孔板，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，换无血清DMEM继续培养24 h，分别给予不同的处理因素，每组4个复孔，培养48 h后分别吸取细胞上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。所有数据以—x±s表示，组间比较采用t检验和方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 脱氢紫堇碱对乳鼠心肌成纤维细胞形态的影响
乳鼠CFs生长迅速，2～3 d即呈融合状态。细胞多呈梭形，胞体较大，胞质透明，细胞核呈椭圆形，通常含2～3个核，无自发性搏动，见图1。蛋白免疫荧光显示，CFs的波形蛋白呈阳性反应，结蛋白呈阴性反应，见图2。
5 讨论
CFs的增殖、细胞外基质（主要是Ⅰ型、Ⅲ型胶原）的过度沉积是心肌纤维化形成的关键。CFs是心脏组织的主要组成细胞，占心脏组织的2/3，具有分泌胶原的作用，各型胶原由纤维连接素固定于心肌细胞和成纤维细胞上，Ⅰ型胶原构成较粗的心肌纤维，使心肌具有良好的顺应性。Ⅲ型胶原和Ⅰ型胶原垂直分布，易于伸展并形成一个牢固的网状结构。对维持心脏正常的形态、功能具有重要价值。纤维化过程中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的比例不断增加，排列出现紊乱，这是导致心肌纤维化的组织学基础。糖尿病时，CFs增殖，CFs数目增多，心肌细胞合成和分泌大量的胶原，生成大于降解，使心肌纤维增粗，导致心室壁厚度增加心室顺应性下降，最终导致心室收缩及舒张功能不全。
本实验结果显示，采用体外高糖培养乳鼠CFs，能够促进CFs增殖，CFs分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原的能力明显增加。这与已有报道一致[4]。
本实验研究发现，DHC干预高糖培养的CFs后，细胞增殖明显抑制，S期细胞增殖周期百分率明显降低，提示该成分能明显抑制CFs的增殖，降低CFs的数量，减轻糖尿病心肌纤维化的进程。进一步研究发现，该成分还可以减少Ⅰ型、Ⅲ型胶原的分泌，表明DHC不仅可以抑制CFs的增殖，还能降低其合成与分泌胶原的能力，进而抑制糖尿病心肌纤维化。
综上所述，DHC能抑制高糖培养的CFs的增殖，降低胶原的合成与分泌，是一种具有潜在治疗糖尿病心肌纤维化的有效成分，其作用机制值得进一步研究。
参考文献：
[1] 黄衍寿，李荣.延胡索碱预处理对缺血再灌注心肌钙泵及钠钾泵活性的影响[C]//中国中西医结合学会心血管病专业委员会.第八次全国中西医结合心血管病学术会议论文集.广州，2007.
[2] 李荣.延胡索碱及延胡索复方抗冠心病室性心律失常的实验与临床研究[D].广州：广州中医药大学，2007.
[3] 张仲苗，耿宝琴，雍定国，等.dl-四氢巴马汀抗大鼠胃溃疡作用[J].中国药学杂志，2005，40（12）：902-904.
[4] Tokudome T， Horio T， Yoshihara F. Direct effect of high glucose and insuline on protein synthesis in cultured cardiac myocytes and DNA and collagen synthesis in cardiac fibroblasts[J]. Metabolism，2004，53（6）：710-715.
（收稿日期：2014-03-04）
（修回日期：2014-03-18；编辑：华强）
关键词：脱氢紫堇碱；体外高糖培养；心肌成纤维细胞；细胞增殖；胶原
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）10-0050-04
Abstract：Objective To observe the effects of dehydrocorydaline （DHC） on proliferation and collagen secretion of cardiac fibroblasts （CFs） cultured by high glucose；To provide experimental evidence for clinical application of Rhizoma Corydalis. Methods CFs cultured in vitro with high glucose were made into models. Collagenase and trypsin were used for the combine digestion of CFs from ratsbornin 24 h. 2-4 generation CFs were cultured by high glucose （25 mmol/L）， and then 100， 50， 25 mg/L dethydrocorydaline was added for intervention. Cellular morphology of CFs was observed after 24， 48 h. CFs proliferation was detected by MTT method. Cell cycle was assessed via flow cytometry. The levels of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ were determined by ELISA. Results CFs began to grow adherence 3 hours after planting， and CFs cultured by high glucose significantly proliferated 24， 48 h later （P<0.05， P<0.01）. The percentage of S+G2+M phase CFs increased significantly after 48 h （P<0.01）. The secretion of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ also increased significantly （P<0.01）. After the intervention of DHC， CFs proliferation was significantly inhibited （P<0.01）；the percentage of S+G2+M phase CFs decreased （P<0.01）；the secretion of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ was reduced （P<0.05， P<0.01）. Conclusion DHC can reduce CFs proliferation， decrease collagen secretion of CFs cultured by high glucose， and has potential effects of anti-myocardial fibrosis.
Key words：dehydrocorydaline；cultured in vitro with high glucose；cardiac fibroblasts；cell proliferation；collagen
糖尿病心肌病是一种独立的、特异的糖尿病并发症，临床特征早期以心脏舒张功能不全，晚期以收缩功能不全为主，易并发心力衰竭及心律失常，心肌纤维化是其主要病理特征。心肌成纤维细胞（CFs）的活化、增殖、合成、分泌胶原是糖尿病心肌纤维化产生的主要原因。脱氢紫堇碱（DHC）是延胡索的主要有效成分，药理研究表明，DHC具有扩张冠状动脉、保护心肌缺血再灌注损伤、改善微循环、降低耗氧量、抑制血小板聚集等作用[1-2]，但有关DHC抗心肌纤维化的研究尚未见报道。本实验采用体外高糖培养的CFs模型，初步观察DHC对CFs增殖与胶原分泌的影响，为延胡索的临床应用提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
出生24 h内SD大鼠乳鼠10只，SPF级，雌雄不限，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：11400700012085。 1.2 药物
DHC对照品（北京鑫方程生物公司，批号120930， 20 mg），卡托普利对照品（中国食品药品检定研究院，批号100318-201103，100 mg）。
1.3 主要试剂与仪器
胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、四甲基偶氮唑盐（MTT）均为Sigma公司进口分装产品，DNA PREP试剂盒（库尔特公司），Ⅰ型、Ⅲ型胶原ELISA试剂盒（USCN公司），小鼠抗波形蛋白单克隆抗体和小鼠抗结蛋白单克隆抗体（Biogenes公司），DMEM高糖、低糖培养基和胎牛血清（FCS）均为GIBCO公司产品。流式细胞分析仪（美国BD公司），酶联免疫分析仪（美国BioTek公司）。
2 实验方法
2.1 心肌成纤维细胞培养与鉴定
参照文献[3]方法加以改进。取出生24 h内的SD大鼠乳鼠，在无菌条件下，开胸摘取心脏，置于4 ℃、0.01%磷酸盐缓冲液中，除去红细胞，75%酒精浸泡30 s后剪成1 mm3大小的碎块，弃去0.01%磷酸盐缓冲液，加入等体积的0.125%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶，37 ℃水浴振荡反复消化10 min，至组织块消失，收集每次消化悬液，10%FCS的DMEM低糖培养液终止消化，收集每次消化悬液，2000 r/min离心10 min，弃上清液，再加入10%的DMEM低糖培养液，制成细胞悬液，接种至培养瓶，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养。根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁分离法贴壁60 min，弃上清液，剩下的为CFs，加入含10%FCS的DMEM低糖培养液继续培养。经免疫组化波形蛋白染色阳性和结蛋白染色阴性为所需的CFs，纯度达98%，台盼蓝染色细胞活力>90%。待80%～90%细胞融合后用0.25%胰酶消化传代（1∶2），实验采用2～4代细胞。
2.2 分组与给药
正常组：DMEM低糖培养基（内含5.5 mmol/L D-葡萄糖）；模型组：DMEM高糖培养液（内含25 mmol/L D-葡萄糖）；高渗组：DMEM培养基（含5.5 mmol/L D-葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇）；DHC高、中、低剂量组：100、50、25 mg/L DHC；对照组：22 mg/L卡托普利。
2.3 细胞增殖检测
将处于对数生长期的CFs制成细胞悬液，以5×104个/mL接种于96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后换无血清DMEM继续培养24 h，分别给予不同的处理因素，每组6个复孔，继续培养24、48 h，再在每孔中加入10 μL（1 g/L）MTT溶液，37 ℃，继续培养4 h，终止培养，弃上清液，加入100 μL DMSO/孔，酶标仪490 nm波长测吸光度（A值）。
2.4 心肌成纤维细胞细胞周期检测
取CFs制成细胞悬液，以1×105个/mL接种于96孔板，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，换无血清DMEM继续培养24 h，给予不同的处理因素，每组3个复孔，培养48 h。用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度1×106个/mL，严格按细胞周期试剂盒说明书操作，在流式细胞仪上进行检测，用MCYCLE软件进行细胞周期分析。
2.5 Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量检测
取CFs制成细胞悬液，以1×105个/mL接种于96孔板，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，换无血清DMEM继续培养24 h，分别给予不同的处理因素，每组4个复孔，培养48 h后分别吸取细胞上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。所有数据以—x±s表示，组间比较采用t检验和方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 脱氢紫堇碱对乳鼠心肌成纤维细胞形态的影响
乳鼠CFs生长迅速，2～3 d即呈融合状态。细胞多呈梭形，胞体较大，胞质透明，细胞核呈椭圆形，通常含2～3个核，无自发性搏动，见图1。蛋白免疫荧光显示，CFs的波形蛋白呈阳性反应，结蛋白呈阴性反应，见图2。
5 讨论
CFs的增殖、细胞外基质（主要是Ⅰ型、Ⅲ型胶原）的过度沉积是心肌纤维化形成的关键。CFs是心脏组织的主要组成细胞，占心脏组织的2/3，具有分泌胶原的作用，各型胶原由纤维连接素固定于心肌细胞和成纤维细胞上，Ⅰ型胶原构成较粗的心肌纤维，使心肌具有良好的顺应性。Ⅲ型胶原和Ⅰ型胶原垂直分布，易于伸展并形成一个牢固的网状结构。对维持心脏正常的形态、功能具有重要价值。纤维化过程中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的比例不断增加，排列出现紊乱，这是导致心肌纤维化的组织学基础。糖尿病时，CFs增殖，CFs数目增多，心肌细胞合成和分泌大量的胶原，生成大于降解，使心肌纤维增粗，导致心室壁厚度增加心室顺应性下降，最终导致心室收缩及舒张功能不全。
本实验结果显示，采用体外高糖培养乳鼠CFs，能够促进CFs增殖，CFs分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原的能力明显增加。这与已有报道一致[4]。
本实验研究发现，DHC干预高糖培养的CFs后，细胞增殖明显抑制，S期细胞增殖周期百分率明显降低，提示该成分能明显抑制CFs的增殖，降低CFs的数量，减轻糖尿病心肌纤维化的进程。进一步研究发现，该成分还可以减少Ⅰ型、Ⅲ型胶原的分泌，表明DHC不仅可以抑制CFs的增殖，还能降低其合成与分泌胶原的能力，进而抑制糖尿病心肌纤维化。
综上所述，DHC能抑制高糖培养的CFs的增殖，降低胶原的合成与分泌，是一种具有潜在治疗糖尿病心肌纤维化的有效成分，其作用机制值得进一步研究。
参考文献：
[1] 黄衍寿，李荣.延胡索碱预处理对缺血再灌注心肌钙泵及钠钾泵活性的影响[C]//中国中西医结合学会心血管病专业委员会.第八次全国中西医结合心血管病学术会议论文集.广州，2007.
[2] 李荣.延胡索碱及延胡索复方抗冠心病室性心律失常的实验与临床研究[D].广州：广州中医药大学，2007.
[3] 张仲苗，耿宝琴，雍定国，等.dl-四氢巴马汀抗大鼠胃溃疡作用[J].中国药学杂志，2005，40（12）：902-904.
[4] Tokudome T， Horio T， Yoshihara F. Direct effect of high glucose and insuline on protein synthesis in cultured cardiac myocytes and DNA and collagen synthesis in cardiac fibroblasts[J]. Metabolism，2004，53（6）：710-715.
（收稿日期：2014-03-04）
（修回日期：2014-03-18；编辑：华强）