论文部分内容阅读
摘要 [目的]对多孔菌漆酶包埋于AOT/异辛烷反胶团中的特性进行研究。[方法]在漆酶反胶团中加入醋酸盐缓冲液和邻联甲苯胺，放入25 ℃恒温箱中培养25 min后离心，取下清液，测光密度值。[结果]在漆酶反胶团体系中加入适量吐温-80后，漆酶反胶团酶活力有所提高。经反胶团包埋后，酶的热稳定性和酸碱稳定性较水相酶有较大提高，在40 ℃下保温30 d酶活力保留81.3%，在pH 4.5下保存30 d酶活力保留89.6%。[结论]在该反胶团体系中， 酶的稳定性有较大的提高。
关键词 多孔菌漆酶；AOT；异辛烷；反胶团；特性表征
中图分类号 S-03 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）18-005-03
多孔菌漆酶对降解含氯有机物的作用是非常明显的，但因其在水相中稳定性不高，因而限制了它的广泛使用。为了增强酶的稳定性，克服在溶解状态易受抑制的缺点，通常采用吸附法[1-3]、交联法[4-6]、共价键结合法[7-9]和包埋法固定化酶[10-12]。与传统固定化方法相比，反胶团包埋酶技术有其独特的优点。反胶团的结构特征使酶在有机溶剂中溶入很小的水环境中，由于表面活性剂的存在而使酶不与有机溶剂直接接触，可更好地保护酶的催化活性部位，因而活性和稳定性得到保留。笔者研究了多孔菌漆酶在二-（2-乙基己基）琥珀酸双酯磺酸钠（AOT）∕异辛烷反胶团中的稳定性，并与相应的游离漆酶进行比较。
1 材料与方法
1.1 试验材料 多孔菌菌种，中科院化学研究所提供；邻联甲苯胺，分析纯，上海化学试剂总厂；AOT气溶胶，浙江嘉善巨枫化工厂；756 MC型紫外可见分光光度计，上海精密科学化器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 游离漆酶活性的测定。取0.1 mol/L 、pH 4.6的醋酸缓冲液3.4 ml，加入3.36 mmol/L邻联甲苯胺0.5 ml，再加入游离漆酶液0.1 ml，25 ℃保温30 min。在756 MC型紫外可见分光光度计下测定600 nm处的光密度（OD值），以空白不含酶溶液为对照。酶活力以酶与底物反应30 min后光密度的改变值表示。以每分钟光密度增加0.01为1个酶活力单位。
1.2.2 反胶团的制备。在含0.1 mol/L AOT的异辛烷溶液中加入一定量的0.02 mol/L、pH 4.6的漆酶醋酸盐缓冲液（其中加入游离漆酶液），立即振荡溶液至澄清，使之形成均一、透明、稳定的反胶团体系，即得所需含水值为R的含酶反胶团。欲改变R值，只需调节注入的缓冲液量即可。R值的定义为有机相中水的摩尔浓度与AOT摩尔浓度之比，即R=[H2O]/[AOT]。
1.2.3 反胶团酶活力的测定。取5 ml漆酶反胶团（其中含游离漆酶0.1 ml），加入0.1 mol/L、pH 4.6的醋酸盐缓冲液3.4 ml，再加入3.36 mmol/L邻联甲苯胺0.5 ml，放入25 ℃恒温箱中培养25 min后，在25 ℃下4 000 r/min的离心机上离心5 min。取下清液，放在756 MC型紫外可见分光光度计测600 nm处的光密度（OD值），以与空白不含酶的为对照。酶活力以漆酶反胶团与底物反应30 min后光密度的改变值表示。以每分钟光密度增加0.01为1个酶活力单位。
1.3 数据分析方法 试验数据用SAS 8.01版统计软件进行处理和分析。采用DMRT法进行多重比较，P值均为0.05。
2 结果与分析
2.1 反胶团中不同含水值及Tween-80浓度对漆酶反胶团活力的影响 反胶团的含水值是反胶团结构的重要参数之一。它会影响漆酶反胶团活力。Tween-80作为一种助表面活性剂，在反胶团中的浓度也会影响漆酶反胶团活力。表1表明，反胶团中不同含水值和Tween-80浓度对漆酶反胶团活力都有显著影响。当反胶团中Tween-80浓度为0.012 5 mol/L时，漆酶反胶团活力提高最显著，当含水值为30时漆酶反胶团活力达到51.97，是未加Tween-80时活力的1.43倍，是游离漆酶活力的1.40倍。这一结果与前人研究报道的关于漆酶在反胶团体系下体现出“超活力”的结论[13]一致。
2.2 制备反胶团时加入不同pH缓冲液对漆酶反胶团活力的影响 由图1可知，加入的缓冲液pH在4.2～5.0之间对漆酶反胶团活力影响不显著，且活力都维持在较高水平。加入缓冲液的最适pH为4.6，此时漆酶反胶团活力为51.97，加入缓冲液的最适pH与“1.2.2”漆酶反胶团的制备方法中加入的缓冲液pH相同。
2.3 温度对漆酶反胶团活力的影响 由图2可知，漆酶反胶团在22～38 ℃之间时活力受温度影响不显著，且活力都维持在较高水平。当漆酶反胶团最适作用温度为30～36 ℃时，活力达到53.70 U。与游离漆酶相比，漆酶反胶团在20～40 ℃的活力变化更小，最适作用温度有所提高。这反映漆酶反胶团的热稳定性较游离漆酶得到提高。郭从容等[14]对青霉素酰胺酶经反胶团包埋后最适作用温度提高5 ℃的报道与该试验结果接近。
2.4 pH对漆酶反胶团活力的影响 由图3可知，漆酶反胶团在pH 3.5～5.3之间时活力变化不显著，且都维持在较高水平。在此pH范围之外，活力都会有所下降，在漆酶反胶团最适作用pH 4.4～4.7时，活力达到51.97 U。
2.5 漆酶反胶团的热稳定性 由图4可知，漆酶反胶团在30、40、50 ℃保存4 d后活力变化显著；30、40、50 ℃保存30 d活力分别保留84.4%、81.3%、62.0%。而游离漆酶在30、40、50 ℃保存30 d活力，分别只保留69.4%、10.5%、6.2%。与游离漆酶液相比，漆酶反胶团热稳定性得到显著提高。
2.6 漆酶反胶团的酸碱稳定性 由图5可知，漆酶反胶团在pH 4.0～5.0下保存较稳定，pH 4.5时保存最稳定，保存30 d活力仅损失10.4%；pH 5.0时保存30 d，活力保留66.3%；但，在pH小于3.0或大于5.5时保存不稳定，在pH 3.0保存30 d，活力仅保留42.5%；pH 6.0时保存30 d，活力仅保留21.0%。与游离漆酶相比，pH 4.5时保存30 d，活力仅保留45.0%；pH 5.0时保存30 d，活力保留20.4%；pH 5.5时保存30 d，活力仅保留13.1%，漆酶反胶团的酸碱稳定性也得到显著提高。 3 结论与讨论
（1）经反胶团包埋后，漆酶的稳定性较游离漆酶有较大提高，热失活和酸碱失活显著减少。这可能是因为酶在反胶团内的微环境比在水溶液中更接近其天然的胞内环境，有利于维持具有催化功能的酶的空间构象，减少其他构象的存在[15]，从而保持较高的酶活性。另一方面，酶的稳定性一般与水化程度有关，不完全水化的酶的稳定性往往较高[16]，因此反胶团体系中有机溶剂的存在也有利于改善酶的稳定性。
（2）反胶团体系中不同含水值、Tween-80浓度以及制备反胶团时加入不同pH的缓冲液对漆酶反胶团活力都有一定影响。当反胶团体系中含水值为30、Tween-80浓度为0.012 5 mol/L、制备反胶团的缓冲液pH为4.6时，制得的反胶团酶活力最高。该酶在AOT/异辛烷反胶团体系中的最适作用温度为30～36 ℃，最适作用pH为4.4～4.7。该条件下反胶团体系较稳定。
参考文献
[1] 朱祥瑞，徐俊良.家蚕丝素固定化α-淀粉酶的制备及其理化特性[J].浙江大学学报：农业生命科学版，2002，28（1）：64-69.
[2] 杨昌英，潘家荣，钟珩，等.醋酸纤维素固定化脂肪酶催化猪油合成单甘酯[J].湖北化工，2002（6）：20-21.
[3] 高贵，韩四平，王智，等.硅藻土固定化脂肪酶[J].吉林大学学报：理学版，2002，40（3）：324-326.
[4] 钱军民，李旭祥，锁爱莉.氨基化硅胶固定化葡萄糖氧化酶和研究[J].生物化学与生物物理进展，2002，29（30）：394-397.
[5] 曾嘉，郑连英，余世清.壳聚糖微球固定化葡萄糖氧化酶的研究[J].食品工业科技，2002，23（1）：29-31.
[6] QUINN Z，ZHOU K，CHEN X D.Immobilization of β-galactosidase on graphite surface by glutaraldehyde[J]. J Food Eng，2001，48（1）：69-74.
[7] 乌云高娃，卢冠忠，郭杨龙，等.聚甲基丙烯酸缩水甘油酯固定化青霉素酰化酶性质的研究[J].华东理工大学学报，2002，28（6）：633-636.
[8] DESSOUKI A M，ISSA G I，ATIA K S.Pullulanase immobilization on natural and syntetic polymers[J].J Chem Technol Biotechnol，2001，76（7）：700-706.
[9] WANG S L，CHIO S H.Reversible immobilization of chitinase via coupling to reversibly soluble polymer[J].Enzyme Microb Technol，1998，22（7）：634-640.
[10] ARVIND M.A simple laboratory experiment for teaching enzyme immobilization with urease and its application in blood urea estimation[J].Biochemical Education，1999，27：114-117.
[11] 钱军民，李旭祥.HES/SiO2凝胶复合物包埋固定化葡萄糖氧化酶的研究[J].应用化学，2002，19（2）：153-157.
[12] 颜慧，冯炘，李军红.扑草净降解酶的固定化及其对受污染土壤的生物强化研究[J].南开大学学报：自然科学版，2003，36（2）：109-115.
[13] PSHEZHESKY A V，KLYACHKO N L，PEPANIYAN G S，et al.Modeling of membrane environment of enzymes：Superactivity of laccase entrapped into surfactant reversed micelles in organic solvents[J].Boikhimiya，1988，53（2）：1013-1016.
[14] 郭从容，何志敏，邹超.青霉素酰胺酶在AOT/异辛烷反胶团中的稳定性研究[J].中国医药工业杂志，1999，30（12）：531-533.
[15] BROWN E D，YADA R Y，MARAGONIA A G.The dependence of the lipolytic activity of rhizopus arrhizus lipase on surfactant concentration in AOT/isooctane reverse micelles and its relationship to enzymes structure[J].Biochim Biophys Acta，1993，1161（1）：66.
[16] YAMADA Y，KUBOI R，KOMASAWA I.Increased activity of Chromobacterium viscosum lipase in aerosol OT reverse micelles in the presence of nonionic surfactants[J].Biotechnol Prog，1993，9：468-472.
关键词 多孔菌漆酶；AOT；异辛烷；反胶团；特性表征
中图分类号 S-03 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）18-005-03
多孔菌漆酶对降解含氯有机物的作用是非常明显的，但因其在水相中稳定性不高，因而限制了它的广泛使用。为了增强酶的稳定性，克服在溶解状态易受抑制的缺点，通常采用吸附法[1-3]、交联法[4-6]、共价键结合法[7-9]和包埋法固定化酶[10-12]。与传统固定化方法相比，反胶团包埋酶技术有其独特的优点。反胶团的结构特征使酶在有机溶剂中溶入很小的水环境中，由于表面活性剂的存在而使酶不与有机溶剂直接接触，可更好地保护酶的催化活性部位，因而活性和稳定性得到保留。笔者研究了多孔菌漆酶在二-（2-乙基己基）琥珀酸双酯磺酸钠（AOT）∕异辛烷反胶团中的稳定性，并与相应的游离漆酶进行比较。
1 材料与方法
1.1 试验材料 多孔菌菌种，中科院化学研究所提供；邻联甲苯胺，分析纯，上海化学试剂总厂；AOT气溶胶，浙江嘉善巨枫化工厂；756 MC型紫外可见分光光度计，上海精密科学化器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 游离漆酶活性的测定。取0.1 mol/L 、pH 4.6的醋酸缓冲液3.4 ml，加入3.36 mmol/L邻联甲苯胺0.5 ml，再加入游离漆酶液0.1 ml，25 ℃保温30 min。在756 MC型紫外可见分光光度计下测定600 nm处的光密度（OD值），以空白不含酶溶液为对照。酶活力以酶与底物反应30 min后光密度的改变值表示。以每分钟光密度增加0.01为1个酶活力单位。
1.2.2 反胶团的制备。在含0.1 mol/L AOT的异辛烷溶液中加入一定量的0.02 mol/L、pH 4.6的漆酶醋酸盐缓冲液（其中加入游离漆酶液），立即振荡溶液至澄清，使之形成均一、透明、稳定的反胶团体系，即得所需含水值为R的含酶反胶团。欲改变R值，只需调节注入的缓冲液量即可。R值的定义为有机相中水的摩尔浓度与AOT摩尔浓度之比，即R=[H2O]/[AOT]。
1.2.3 反胶团酶活力的测定。取5 ml漆酶反胶团（其中含游离漆酶0.1 ml），加入0.1 mol/L、pH 4.6的醋酸盐缓冲液3.4 ml，再加入3.36 mmol/L邻联甲苯胺0.5 ml，放入25 ℃恒温箱中培养25 min后，在25 ℃下4 000 r/min的离心机上离心5 min。取下清液，放在756 MC型紫外可见分光光度计测600 nm处的光密度（OD值），以与空白不含酶的为对照。酶活力以漆酶反胶团与底物反应30 min后光密度的改变值表示。以每分钟光密度增加0.01为1个酶活力单位。
1.3 数据分析方法 试验数据用SAS 8.01版统计软件进行处理和分析。采用DMRT法进行多重比较，P值均为0.05。
2 结果与分析
2.1 反胶团中不同含水值及Tween-80浓度对漆酶反胶团活力的影响 反胶团的含水值是反胶团结构的重要参数之一。它会影响漆酶反胶团活力。Tween-80作为一种助表面活性剂，在反胶团中的浓度也会影响漆酶反胶团活力。表1表明，反胶团中不同含水值和Tween-80浓度对漆酶反胶团活力都有显著影响。当反胶团中Tween-80浓度为0.012 5 mol/L时，漆酶反胶团活力提高最显著，当含水值为30时漆酶反胶团活力达到51.97，是未加Tween-80时活力的1.43倍，是游离漆酶活力的1.40倍。这一结果与前人研究报道的关于漆酶在反胶团体系下体现出“超活力”的结论[13]一致。
2.2 制备反胶团时加入不同pH缓冲液对漆酶反胶团活力的影响 由图1可知，加入的缓冲液pH在4.2～5.0之间对漆酶反胶团活力影响不显著，且活力都维持在较高水平。加入缓冲液的最适pH为4.6，此时漆酶反胶团活力为51.97，加入缓冲液的最适pH与“1.2.2”漆酶反胶团的制备方法中加入的缓冲液pH相同。
2.3 温度对漆酶反胶团活力的影响 由图2可知，漆酶反胶团在22～38 ℃之间时活力受温度影响不显著，且活力都维持在较高水平。当漆酶反胶团最适作用温度为30～36 ℃时，活力达到53.70 U。与游离漆酶相比，漆酶反胶团在20～40 ℃的活力变化更小，最适作用温度有所提高。这反映漆酶反胶团的热稳定性较游离漆酶得到提高。郭从容等[14]对青霉素酰胺酶经反胶团包埋后最适作用温度提高5 ℃的报道与该试验结果接近。
2.4 pH对漆酶反胶团活力的影响 由图3可知，漆酶反胶团在pH 3.5～5.3之间时活力变化不显著，且都维持在较高水平。在此pH范围之外，活力都会有所下降，在漆酶反胶团最适作用pH 4.4～4.7时，活力达到51.97 U。
2.5 漆酶反胶团的热稳定性 由图4可知，漆酶反胶团在30、40、50 ℃保存4 d后活力变化显著；30、40、50 ℃保存30 d活力分别保留84.4%、81.3%、62.0%。而游离漆酶在30、40、50 ℃保存30 d活力，分别只保留69.4%、10.5%、6.2%。与游离漆酶液相比，漆酶反胶团热稳定性得到显著提高。
2.6 漆酶反胶团的酸碱稳定性 由图5可知，漆酶反胶团在pH 4.0～5.0下保存较稳定，pH 4.5时保存最稳定，保存30 d活力仅损失10.4%；pH 5.0时保存30 d，活力保留66.3%；但，在pH小于3.0或大于5.5时保存不稳定，在pH 3.0保存30 d，活力仅保留42.5%；pH 6.0时保存30 d，活力仅保留21.0%。与游离漆酶相比，pH 4.5时保存30 d，活力仅保留45.0%；pH 5.0时保存30 d，活力保留20.4%；pH 5.5时保存30 d，活力仅保留13.1%，漆酶反胶团的酸碱稳定性也得到显著提高。 3 结论与讨论
（1）经反胶团包埋后，漆酶的稳定性较游离漆酶有较大提高，热失活和酸碱失活显著减少。这可能是因为酶在反胶团内的微环境比在水溶液中更接近其天然的胞内环境，有利于维持具有催化功能的酶的空间构象，减少其他构象的存在[15]，从而保持较高的酶活性。另一方面，酶的稳定性一般与水化程度有关，不完全水化的酶的稳定性往往较高[16]，因此反胶团体系中有机溶剂的存在也有利于改善酶的稳定性。
（2）反胶团体系中不同含水值、Tween-80浓度以及制备反胶团时加入不同pH的缓冲液对漆酶反胶团活力都有一定影响。当反胶团体系中含水值为30、Tween-80浓度为0.012 5 mol/L、制备反胶团的缓冲液pH为4.6时，制得的反胶团酶活力最高。该酶在AOT/异辛烷反胶团体系中的最适作用温度为30～36 ℃，最适作用pH为4.4～4.7。该条件下反胶团体系较稳定。
参考文献
[1] 朱祥瑞，徐俊良.家蚕丝素固定化α-淀粉酶的制备及其理化特性[J].浙江大学学报：农业生命科学版，2002，28（1）：64-69.
[2] 杨昌英，潘家荣，钟珩，等.醋酸纤维素固定化脂肪酶催化猪油合成单甘酯[J].湖北化工，2002（6）：20-21.
[3] 高贵，韩四平，王智，等.硅藻土固定化脂肪酶[J].吉林大学学报：理学版，2002，40（3）：324-326.
[4] 钱军民，李旭祥，锁爱莉.氨基化硅胶固定化葡萄糖氧化酶和研究[J].生物化学与生物物理进展，2002，29（30）：394-397.
[5] 曾嘉，郑连英，余世清.壳聚糖微球固定化葡萄糖氧化酶的研究[J].食品工业科技，2002，23（1）：29-31.
[6] QUINN Z，ZHOU K，CHEN X D.Immobilization of β-galactosidase on graphite surface by glutaraldehyde[J]. J Food Eng，2001，48（1）：69-74.
[7] 乌云高娃，卢冠忠，郭杨龙，等.聚甲基丙烯酸缩水甘油酯固定化青霉素酰化酶性质的研究[J].华东理工大学学报，2002，28（6）：633-636.
[8] DESSOUKI A M，ISSA G I，ATIA K S.Pullulanase immobilization on natural and syntetic polymers[J].J Chem Technol Biotechnol，2001，76（7）：700-706.
[9] WANG S L，CHIO S H.Reversible immobilization of chitinase via coupling to reversibly soluble polymer[J].Enzyme Microb Technol，1998，22（7）：634-640.
[10] ARVIND M.A simple laboratory experiment for teaching enzyme immobilization with urease and its application in blood urea estimation[J].Biochemical Education，1999，27：114-117.
[11] 钱军民，李旭祥.HES/SiO2凝胶复合物包埋固定化葡萄糖氧化酶的研究[J].应用化学，2002，19（2）：153-157.
[12] 颜慧，冯炘，李军红.扑草净降解酶的固定化及其对受污染土壤的生物强化研究[J].南开大学学报：自然科学版，2003，36（2）：109-115.
[13] PSHEZHESKY A V，KLYACHKO N L，PEPANIYAN G S，et al.Modeling of membrane environment of enzymes：Superactivity of laccase entrapped into surfactant reversed micelles in organic solvents[J].Boikhimiya，1988，53（2）：1013-1016.
[14] 郭从容，何志敏，邹超.青霉素酰胺酶在AOT/异辛烷反胶团中的稳定性研究[J].中国医药工业杂志，1999，30（12）：531-533.
[15] BROWN E D，YADA R Y，MARAGONIA A G.The dependence of the lipolytic activity of rhizopus arrhizus lipase on surfactant concentration in AOT/isooctane reverse micelles and its relationship to enzymes structure[J].Biochim Biophys Acta，1993，1161（1）：66.
[16] YAMADA Y，KUBOI R，KOMASAWA I.Increased activity of Chromobacterium viscosum lipase in aerosol OT reverse micelles in the presence of nonionic surfactants[J].Biotechnol Prog，1993，9：468-472.