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【摘要】 探讨石蜡标本中大肠癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群单细胞悬液样本的制备方法。石蜡标本经切片、脱蜡、水化、消化、过滤、收集细胞等步骤制成单细胞悬液，滴加单克隆抗体，通过流式细胞仪检测，最后进行淋巴细胞亚群细胞分型获取及读数。
【关键词】 大肠癌； 肿瘤浸润淋巴细胞； 石蜡包埋； 流式细胞术
肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL）在体内外具有较强特异性杀伤肿瘤细胞的作用[1-2]。以往对肿瘤浸润淋巴细胞的研究多从病理角度探讨，对其淋巴细胞分型及量的表达研究甚少。随着免疫检测技术的发展，特别是流式细胞术（flow cytometry，FCM）应用于免疫研究越来越广泛，并具有快捷、敏感及多参数定量分析等优点，目前这种检测技术主要应用于临床新鲜肿瘤组织和血液细胞研究[3-6]。近年来石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围，临床病理资料的石蜡组织通过流式细胞术检测分析，得到进一步的研究及利用。在石蜡包埋大肠癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群样本制备国内外文献鲜有报道，本实验选取1990年6月-2006年6月本院60例石蜡包埋大肠癌组织，反复对大肠癌肿瘤淋巴单细胞悬液的制备方法进行探索，获得了比较满意的效果。
1 材料与方法
1.1 实验材料 选取本院普通外科1990年6月-2006年6月收集的大肠石蜡标本组织共60例，标本组织均为病理证实的大肠癌组织，并进行单细胞悬液的制作。
1.2 方法
1.2.1 切片 将石蜡包埋组织切成40 μm厚的组织片，取7～8片放入10 mL试管中。
1.2.2 脱蜡 加入二甲苯5 mL，室温中放置2 d，每天更换一次二甲苯，观察石蜡是否脱净，如组织切片全部在试管底部，表明石蜡已完全脱净。
1.2.3 水化 依次加入100%、95%、70%、50%梯度酒精5 mL，每步时间均为10 min，然后加入0.9%生理盐水漂洗后弃之。
1.2.4 消化 用剪刀剪碎组织，大小约1×1 mm，加入0.5%胃蛋白酶液2 mL（pH 1.5～2.0），置于37 ℃恒温水浴中消化30 min，每隔5 min震荡1次。消化30 min中后取出试管，组织成浆糊状，立即加入0.9%生理盐水终止。
1.2.5 过滤 经300目尼龙网过滤，未过滤的组织可利用眼科剪剪碎较大组织团块，生理盐水反复冲洗，直至细胞完全滤过尼龙网。吸管吹打单悬细胞液，防止细胞叠加。
1.2.6 收集淋巴细胞 将离心机调至1500 r/min离心10 min，0.9%生理盐水漂洗，将单细胞悬液滴加至淋巴细胞分离液（密度1.077），梯度离心后取中间一层细胞即为淋巴细胞。800 r/min低速离心（2 min，2次），以去除细胞碎片。
1.2.7 流式细胞仪检测 血细胞计数板读取细胞数并调整单悬细胞浓度，取100 μL约1×106细胞至流式检测管中，加入单克隆荧光抗体，混匀后室温避光孵育30 min，2 mL PBS漂洗，离心弃上清，最后加入固定液多聚甲醛150 μL上流式细胞仪检测。
2 结果
单悬细胞经镜检发现细胞形态完整、分散度好、细胞叠加及碎片少，背景干净。通过血细胞板读数见计数板每格内细胞数>10个，流式细胞术检查均得到满意图组，见图1。
3 讨论
流式细胞术在肿瘤检测方面成为越来越重要的手段之一[7-8]。自1983年Hedley成功报道了石蜡包埋肿瘤组织制备单细胞悬液方法后，大量的石蜡组织用于FCM技术，从而为肿瘤的诊断及预后提供了重要依据。但对于石蜡包埋肿瘤浸润淋巴细胞的制备研究较少，这主要与肿瘤浸润淋巴组织的单细胞悬液的制备较为困难有关，本实验以Hedley制作单细胞悬液的方法为基础，对60例石蜡包埋大肠癌肿瘤浸润淋巴细胞的单细胞悬液制备进行探索。
肿瘤浸润淋巴细胞的单细胞悬液制备是流式细胞术分析成功与否的关键之一。本实验在预实验阶段曾采用胰蛋白酶作为大肠癌肿瘤组织的消化，但所得细胞浓度偏低，这可能与胰蛋白酶消化所需偏碱性环境有关，而应用胃蛋白酶在pH值1.5～2.0中消化获得的单细胞悬液明显增多。另一方面，在实验初期采用机械法即研磨法，由于用力的不同，研磨过程中容易使完整的细胞受损，形成细胞碎片，使染色后出现低荧光性，出现假阳性，导致细胞检出率较高。后期在研磨过程中注意动作轻柔，研磨均匀，同时在研磨过程中需生理盐水反复冲洗，防止组织细胞多次研磨遭破坏，最终在光镜下所观察的细胞形态较完整，背景干净。因此本项实验通过对单细胞悬液制备，总结了以下心得体会：（1）标本的选取：石蜡包埋组织块需为完整，镜检大肠癌周围淋巴细胞丰富；（2）切片质量：实验证明病理切片厚度在40 μm左右较为理想，如切片过薄易形成细胞碎片，过厚则不易消化，容易形成细胞团块；（3）脱蜡：切片脱蜡时间在室温2 d可完全脱净，如冬天室温低，则需延长脱蜡时间或升高室内温度，同时观察如试管内切片无上浮则表明脱蜡干净；（4）漂洗：切片经酒精水化后，需生理盐水充分漂洗，酒精残留则会破坏消化酶作用。勿用蒸馏水漂洗，这样容易因低渗造成细胞膜结构的破坏；（5）组织的消化：选择合适的消化酶，高度角化的鳞癌组织细胞排列紧密，选择胶原蛋白酶较理想，软组织肉瘤使用胰蛋白酶及脯蛋白酶较合适[9]。Zalupski等[10]对15例肉瘤组织进行单悬细胞的制备，实验结果表明胰蛋白酶及脯蛋白酶提取优于胃蛋白酶，悬液单细胞明显增多。胃肠道及肝脏肿瘤应用胰蛋白酶及胃蛋白酶明显优于其他酶液[11]。本实验使用胃蛋白酶，调整酶液pH值在1.5～2.0，100 mL生理盐水中加入胃蛋白酶0.5 g，消化前需将组织剪碎，约1 mm×1 mm大小，使组织与消化液充分接触，酶解完全。（6）减少细胞丢失：单细胞悬液因多次离心漂洗后使得大量细胞丢失，因此在离心时应选择水平离心机，这可使细胞沉淀于试管底部，而使用垂直离心机容易使细胞附着试管管壁，去上清液时很容易造成细胞的丢失，同时改倒掉上清液为吸管吸出上清液，这样能大大减少细胞的丢失，从而达到流式细胞仪检测所需细胞数量。 本实验通过对石蜡包埋大肠癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的单细胞悬液的成功制备，并应用于流式细胞仪检测。为进一步再分析大肠癌淋巴细胞免疫状态与大肠癌病理特征、患者临床分期及预后之间的联系均具有实用意义。
参考文献
[1] Dudley M E，Wunderlich J R，Robbins P F，et al.Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes[J].Science，2002，298（5594）：850-854.
[2] Uekusa Y，Yu W G，Mukai T，et al.A pivotal role for CC chemokine receptor 5 in T-cell migration to tumor sites induced by interleukin 12 treatment in tumor-bearing mice[J].Cancer Res，2002，62（13）：3751-3758.
[3]杨雪峰，杨伟明，刘宙，等.CD83，CD1a和Ki-67在大肠癌中的表达及意义[J].世界华人消化杂志，2010，18（3）：256-261.
[4]刘宙，杨伟明，赵洪远，等.CD83，CD1a标记肿瘤浸润性树突状细胞在大肠癌中的表达及其临床意义[J].西安交通大学学报：医学版，2011，32（1）：124-127.
[5]庄建良，苏子剑，潘群雄，等.大肠癌CD24的表达及其与肿瘤细胞增殖和血管形成的关系[J].世界华人消化杂志，2007，15（3）：260-265.
[6]黄晶.恶性肿瘤患者化疗前后免疫学指标的变化及临床应用探讨[J].中国医学创新，2012，9（4）：22-23.
[7]李天客，李向春，陈彦平，等.流式细胞术分析口腔肿瘤患者外周血细胞免疫变化[J].口腔医学，2011，31（9）：536-538.
[8]王秀丽，范乃军，赵光，等.流式细胞术在临床肿瘤学中的应用[J].实用医药杂志，2012，29（5）：464-466.
[9]任兴昌，方黎，陈洪勋.实体组织单细胞悬液制备方法[J].临床与实验病理学杂志，2007，23（4）：490-491.
[10] Zalupski M M，Maciorowski Z，Ryan J R，et al.DNA content parameters of paraffin-embedded soft tissue sarcomas：optimization of retrieval technique and comparison to fresh tissue[J].Cytometry，1993，14（3）：327-333.
[11]李琦，易光明，周铭，等.胃肠道间质瘤石蜡组织DNA倍体及CD117流式细胞术分析[J].国际检验医学杂志，2012，33（19）：2348-2353.
（收稿日期：2013-12-18） （本文编辑：欧丽）
【关键词】 大肠癌； 肿瘤浸润淋巴细胞； 石蜡包埋； 流式细胞术
肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL）在体内外具有较强特异性杀伤肿瘤细胞的作用[1-2]。以往对肿瘤浸润淋巴细胞的研究多从病理角度探讨，对其淋巴细胞分型及量的表达研究甚少。随着免疫检测技术的发展，特别是流式细胞术（flow cytometry，FCM）应用于免疫研究越来越广泛，并具有快捷、敏感及多参数定量分析等优点，目前这种检测技术主要应用于临床新鲜肿瘤组织和血液细胞研究[3-6]。近年来石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围，临床病理资料的石蜡组织通过流式细胞术检测分析，得到进一步的研究及利用。在石蜡包埋大肠癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群样本制备国内外文献鲜有报道，本实验选取1990年6月-2006年6月本院60例石蜡包埋大肠癌组织，反复对大肠癌肿瘤淋巴单细胞悬液的制备方法进行探索，获得了比较满意的效果。
1 材料与方法
1.1 实验材料 选取本院普通外科1990年6月-2006年6月收集的大肠石蜡标本组织共60例，标本组织均为病理证实的大肠癌组织，并进行单细胞悬液的制作。
1.2 方法
1.2.1 切片 将石蜡包埋组织切成40 μm厚的组织片，取7～8片放入10 mL试管中。
1.2.2 脱蜡 加入二甲苯5 mL，室温中放置2 d，每天更换一次二甲苯，观察石蜡是否脱净，如组织切片全部在试管底部，表明石蜡已完全脱净。
1.2.3 水化 依次加入100%、95%、70%、50%梯度酒精5 mL，每步时间均为10 min，然后加入0.9%生理盐水漂洗后弃之。
1.2.4 消化 用剪刀剪碎组织，大小约1×1 mm，加入0.5%胃蛋白酶液2 mL（pH 1.5～2.0），置于37 ℃恒温水浴中消化30 min，每隔5 min震荡1次。消化30 min中后取出试管，组织成浆糊状，立即加入0.9%生理盐水终止。
1.2.5 过滤 经300目尼龙网过滤，未过滤的组织可利用眼科剪剪碎较大组织团块，生理盐水反复冲洗，直至细胞完全滤过尼龙网。吸管吹打单悬细胞液，防止细胞叠加。
1.2.6 收集淋巴细胞 将离心机调至1500 r/min离心10 min，0.9%生理盐水漂洗，将单细胞悬液滴加至淋巴细胞分离液（密度1.077），梯度离心后取中间一层细胞即为淋巴细胞。800 r/min低速离心（2 min，2次），以去除细胞碎片。
1.2.7 流式细胞仪检测 血细胞计数板读取细胞数并调整单悬细胞浓度，取100 μL约1×106细胞至流式检测管中，加入单克隆荧光抗体，混匀后室温避光孵育30 min，2 mL PBS漂洗，离心弃上清，最后加入固定液多聚甲醛150 μL上流式细胞仪检测。
2 结果
单悬细胞经镜检发现细胞形态完整、分散度好、细胞叠加及碎片少，背景干净。通过血细胞板读数见计数板每格内细胞数>10个，流式细胞术检查均得到满意图组，见图1。
3 讨论
流式细胞术在肿瘤检测方面成为越来越重要的手段之一[7-8]。自1983年Hedley成功报道了石蜡包埋肿瘤组织制备单细胞悬液方法后，大量的石蜡组织用于FCM技术，从而为肿瘤的诊断及预后提供了重要依据。但对于石蜡包埋肿瘤浸润淋巴细胞的制备研究较少，这主要与肿瘤浸润淋巴组织的单细胞悬液的制备较为困难有关，本实验以Hedley制作单细胞悬液的方法为基础，对60例石蜡包埋大肠癌肿瘤浸润淋巴细胞的单细胞悬液制备进行探索。
肿瘤浸润淋巴细胞的单细胞悬液制备是流式细胞术分析成功与否的关键之一。本实验在预实验阶段曾采用胰蛋白酶作为大肠癌肿瘤组织的消化，但所得细胞浓度偏低，这可能与胰蛋白酶消化所需偏碱性环境有关，而应用胃蛋白酶在pH值1.5～2.0中消化获得的单细胞悬液明显增多。另一方面，在实验初期采用机械法即研磨法，由于用力的不同，研磨过程中容易使完整的细胞受损，形成细胞碎片，使染色后出现低荧光性，出现假阳性，导致细胞检出率较高。后期在研磨过程中注意动作轻柔，研磨均匀，同时在研磨过程中需生理盐水反复冲洗，防止组织细胞多次研磨遭破坏，最终在光镜下所观察的细胞形态较完整，背景干净。因此本项实验通过对单细胞悬液制备，总结了以下心得体会：（1）标本的选取：石蜡包埋组织块需为完整，镜检大肠癌周围淋巴细胞丰富；（2）切片质量：实验证明病理切片厚度在40 μm左右较为理想，如切片过薄易形成细胞碎片，过厚则不易消化，容易形成细胞团块；（3）脱蜡：切片脱蜡时间在室温2 d可完全脱净，如冬天室温低，则需延长脱蜡时间或升高室内温度，同时观察如试管内切片无上浮则表明脱蜡干净；（4）漂洗：切片经酒精水化后，需生理盐水充分漂洗，酒精残留则会破坏消化酶作用。勿用蒸馏水漂洗，这样容易因低渗造成细胞膜结构的破坏；（5）组织的消化：选择合适的消化酶，高度角化的鳞癌组织细胞排列紧密，选择胶原蛋白酶较理想，软组织肉瘤使用胰蛋白酶及脯蛋白酶较合适[9]。Zalupski等[10]对15例肉瘤组织进行单悬细胞的制备，实验结果表明胰蛋白酶及脯蛋白酶提取优于胃蛋白酶，悬液单细胞明显增多。胃肠道及肝脏肿瘤应用胰蛋白酶及胃蛋白酶明显优于其他酶液[11]。本实验使用胃蛋白酶，调整酶液pH值在1.5～2.0，100 mL生理盐水中加入胃蛋白酶0.5 g，消化前需将组织剪碎，约1 mm×1 mm大小，使组织与消化液充分接触，酶解完全。（6）减少细胞丢失：单细胞悬液因多次离心漂洗后使得大量细胞丢失，因此在离心时应选择水平离心机，这可使细胞沉淀于试管底部，而使用垂直离心机容易使细胞附着试管管壁，去上清液时很容易造成细胞的丢失，同时改倒掉上清液为吸管吸出上清液，这样能大大减少细胞的丢失，从而达到流式细胞仪检测所需细胞数量。 本实验通过对石蜡包埋大肠癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的单细胞悬液的成功制备，并应用于流式细胞仪检测。为进一步再分析大肠癌淋巴细胞免疫状态与大肠癌病理特征、患者临床分期及预后之间的联系均具有实用意义。
参考文献
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[4]刘宙，杨伟明，赵洪远，等.CD83，CD1a标记肿瘤浸润性树突状细胞在大肠癌中的表达及其临床意义[J].西安交通大学学报：医学版，2011，32（1）：124-127.
[5]庄建良，苏子剑，潘群雄，等.大肠癌CD24的表达及其与肿瘤细胞增殖和血管形成的关系[J].世界华人消化杂志，2007，15（3）：260-265.
[6]黄晶.恶性肿瘤患者化疗前后免疫学指标的变化及临床应用探讨[J].中国医学创新，2012，9（4）：22-23.
[7]李天客，李向春，陈彦平，等.流式细胞术分析口腔肿瘤患者外周血细胞免疫变化[J].口腔医学，2011，31（9）：536-538.
[8]王秀丽，范乃军，赵光，等.流式细胞术在临床肿瘤学中的应用[J].实用医药杂志，2012，29（5）：464-466.
[9]任兴昌，方黎，陈洪勋.实体组织单细胞悬液制备方法[J].临床与实验病理学杂志，2007，23（4）：490-491.
[10] Zalupski M M，Maciorowski Z，Ryan J R，et al.DNA content parameters of paraffin-embedded soft tissue sarcomas：optimization of retrieval technique and comparison to fresh tissue[J].Cytometry，1993，14（3）：327-333.
[11]李琦，易光明，周铭，等.胃肠道间质瘤石蜡组织DNA倍体及CD117流式细胞术分析[J].国际检验医学杂志，2012，33（19）：2348-2353.
（收稿日期：2013-12-18） （本文编辑：欧丽）