高迁移率族蛋白B1/聚乙二醇-聚乙烯亚胺基因传递系统的构建及性能研究

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安全、有效的载体系统是基因治疗成功的关键因素之一,普遍使用的载体系统包括病毒载体和非病毒载体两类,非病毒载体较病毒载体的安全性有了明显的提高,但到目前为止非病毒型载体的低转染率一直是研究急需解决的问题。对非病毒载体进行化学改性,偶联配体或复合功能性多肽是目前提高其转染效率的主要手段。本文使用HMGB1/PEG—PEI作为基因载体,通过对该基因传递系统进行优化,以期成为具有高转染效率、低毒性、稳定性好的基因传递系统。主要研究了以下几方面的内容: ⑴接枝共聚物PEG—PEI的合成和表征:以IPDI为扩链剂合成PEG—PEI共聚物,通过1H—NMR/13C—NMR、FT—IR、DSC、TGA等对共聚物进行结构表征,确认生成PEG—PEI共聚物。结果显示共聚物中PEG与PEI两嵌段间有氢键的相互作用,为部分相容的微相结构。 ⑵复合载体HMGB1/PEG—PEI的细胞毒性研究:以MTT法考察复合载体的细胞毒性。结果显示,复合HMGB1后对PEI的细胞毒性无明显影响,在复合载体中对PEI进行一定程度PEG化修饰可降低载体的细胞毒性,PEG化程度越高,细胞毒性越低,复合载体HMGB1/PEG—PEI的毒性低于常用阳离子聚合物PEI。比较复合载体HMGB1/PEG—PEI在HeLa、NIH3T3、COS—7细胞中的IC50值,复合载体HMGB1/PEG—PEI在这三种细胞中的IC50值均显著高于PEI,进一步说明复合载体HMGB1/PEG—PEI的细胞毒性低于PEI,结果显示各细胞系对复合载体HMGB1/PEG—PEI的耐受性大小排序为:NIH3T3>HeLa>COS—7。 ⑶pDNA/HMGB1/PEG—PEI三元复合物形成的研究:本章利用圆二色光谱(CD)证明pDNA与HMGB1、pDNA与PEG—PEI之间存在相互作用。原子力显微镜(AFM)观察pDNA/HMGB1二元复合物和pDNA/HMGB1/PEG—PEI三元复合物的表面形貌确认HMGB1可有效结合pDNA,但压缩pDNA的能力弱于PEG—PEI,采用两步法制备pDNA/HMGB1/PEG—PEI三元复合物可以压缩pDNA形成粒径均匀的纳米级别的粒子。 ⑷pDNA/HMGB1/PEG—PEI复合物的性能研究:透射电镜(TEM)观察pDNA/HMGB1/PEG—PEI复合物粒子形态呈球形。动态光散射法(DLS)测定pDNA/HMGB1/PEG—PEI复合物粒径在20~70nm范围,结果显示复合HMGB1后,pDNA/HMGB1/PEG—PEI复合物纳米粒粒径变化不明显;接枝一定量的PEG可明显降低复合物的粒径,但接枝量过高时(PEG接枝量大于56%)反而使复合物的粒径增大;pDNA/HMGB1/PEG—PEI复合物粒子稳定性好,长时间孵育粒径未见明显增大;pDNA/HMGB1/PEG—PEI复合物粒子在离子强度不同的介质中均表现出相似的粒径,具有良好的稳定性。复合HMGB1后对pDNA/HMGB1/PEG—PEI复合物的表面电位影响不大;PEG化可弱化在不同介质中复合物表面电位的差异,使pDNA/HMGB1/PEG—PEI复合物具有良好的稳定性。以琼脂糖凝胶电泳试验考察复合载体HMGB1/PEG—PEI压缩结合pDNA的能力,结果显示HMGB1可协助PEG—PEI与pDNA结合,PEG接枝量较少时PEG—PEI结合pDNA的能力没有受到明显影响,当PEG接枝量大于56%时,PEG—PEI结合pDNA的能力有所下降。通过对核酸酶稳定性试验考察pDNA/HMGB1/PEG—PEI复合物对DNaseⅠ酶的稳定性,结果显示HMGB1/PEG—PEI与pDNA形成的复合物后均可以保护pDNA不被DNaseⅠ酶降解。 ⑸pDNA/HMGB1/PEG—PEI复合物体外转染的研究:利用复合载体HMGB1/PEG—PEI介导增强型绿色荧光蛋白报告基因(pEGFP—C1)转染HeLa细胞,以流式细胞仪和荧光显微图片考察其转染效率。结果显示,pEGFP—C1/HMGB1/PEG—PEI—5在HMGB1/pEGFP—C1质量比为10(w/w10),N/P20时转染率达到最高值,转染率为44.2%,显著高于常用阳离子基因载体PEI(转染率为9.0%)。本文利用pEGFP—C1/HMGB1/PEG—PEI—5(w/w10,N/P20)复合物考察了细胞类型,复合物的分散介质对转染效率的影响,结果显示pEGFP—C1/HMGB1/PEG—PEI—5(w/w10,N/P20)在NIH3T3、COS—7细胞的转染率均高于PEI;复合物分散介质为去离子水可以使pEGFP—C1/HMGB1/PEG—PEI—5复合物转染率达到最大。复合HMGB1和对PEI进行PEG化修饰均能减弱血清对转染的阻碍作用。 ⑹HMGB1/PEG—PEI介导目的基因pEGFP—VEGF165基因转染的研究:利用ELISA法和RT—PCR法考察复合载体HMGB1/PEG—PEI介导目的基因pEGFP—VEGF165转染细胞后细胞培养上清液中VEGF蛋白的表达水平以及细胞中VEGF mRNA的表达情况。ELISA法证实复合载体HMGB1/PEG—PEI能在体外成功介导目的基因pEGFP—VEGF165转染多种细胞系并表达出VEGF蛋白,蛋白表达量高于PEI所介导的体外转染的蛋白表达量。RT—PCR法检测经复合载体HMGB1/PEG—PEI介导目的基因pEGFP—VEGF165转染的多种细胞内含有的VEGF mRNA的表达量,该表达量同样高于PEI所介导的体外转染的VEGFmRNA表达量。 ⑺激光共聚物显微镜观察复合载体HMGB1/PEG—PEI介导基因传递的核转运作用:利用激光共聚焦荧光显微镜(CLSM)观察复合载体HMGB1/PEG—PEI与荧光标记的pDNA形成的复合物转染NIH3T3细胞后pDNA的亚细胞定位情况,结果显示,与阳离子聚合物PEI相比,复合载体HMGB1/PEG—PEI介导的基因传递使pDNA的入核效率提高,表明复合载体HMGB1/PEG—PEI介导基因传递突破核膜屏障的效果优于PEI。
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