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2,3-丁二醇（2,3-Butanediol,2,3-BD）是一种重要的平台化合物,广泛应用在化工、食品、医药以及航空航天等多个领域。目前国内外对其需求量巨大,在石油紧缺的背景下,人们主要采用微生物发酵法进行生产。然而,目前生产2,3-丁二醇的菌株大都具有致病性,违背了大规模工业化生产的安全性原则。因此,选择安全无致病性菌株进行2,3-丁二醇的生产已经成为了国内外的研究热点。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）安全无致病性,具有培养条件简单、生长繁殖迅速以及副产物较少等优点,被看作是真核的模式生物,广泛应用于传统和现代生物技术领域,因此将其作为2,3-丁二醇产生菌,将具有很大优势。然而,该菌株在利用葡萄糖代谢产生2,3-丁二醇过程中,大部分碳源会优先利用产生乙醇,乙醇的积累大大限制了2,3-丁二醇的产量。因此,若想提高2,3-丁二醇产量,阻断其乙醇的产生路径成为首选方案。本研究即是以此为出发点,利用同源重组手段分别敲除出发菌株中乙醇代谢途径的关键酶┄丙酮酸脱羧酶基因Ⅴ（pyruvate decarboxylase,pdc5）和丙酮酸脱羧酶基因Ⅰ（pyruvate decarboxylase,pdc1）,阻断乙醇的生成途径,促使碳源更多流向2,3-丁二醇生成途径,进而获得高产2,3-丁二醇工程菌。研究分为两个部分,首先是出发菌株的筛选及其性质分析。利用摇瓶发酵的方法,在检测了三株候选菌株产醇的性质的同时,根据菌株乙醇转化率、生长状况、中间产物积累量和关键酶活,确定S.cerevisiae W5为出发菌株,结果表明,在最适发酵条件为80 g/L葡萄糖发酵培养基,30℃,200 r/min下,S.cerevisiae W5乙醇最大转化率为0.397±0.02 g/g,较S.cerevisiae WBG3（0.441±0.02 g/g）和S.cerevisiae RHZ7（0.433±0.01 g/g）分别低10.0%和8.3%。改变发酵液的酸碱条件表明,在发酵12 h时加入0.2 g碳酸钙使三株菌乙醇产量分别提高了16.80%、-7.72%和10.41%,转化率分别提高了43.58%、10.20%和11.09%;发酵起始时加入0.5%的乙酸使三株菌乙醇产量分别降低了8.59%、8.49%和16.93%,转化率分别降低了6.30%、8.84%和12.01%。通过对三株菌株产2,3-丁二醇关键中间代谢产物含量测定可知,S.cerevisiae W5对丙酮酸、乙偶姻和α-乙酰乳酸的积累量最大,分别为0.189±0.006 g/L、0.276±0.008 g/L和3.475±0.035 g/L,分别是S.cerevisiae WBG3和RHZ7的1.99倍和2.45倍、2.85倍和1.42倍、1.03倍和1.04倍。因此,将S.cerevisiae W5作为出发菌株。同时,利用果糖-6-磷酸激酶试剂盒、丙酮酸激酶试剂盒、丙酮酸脱羧酶活性测定试剂盒、乙醇脱氢酶活性测定试剂盒和乳酸脱氢酶试剂盒,对S.cerevisiae W5代谢葡萄糖过程的关键酶活进行检测,结果显示果糖-6-磷酸激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶最大酶活分别为8.417±0.190 U/mg（24 h）、98.410±2.952 U/mg（24 h）、0.258±0.003 U/mg（24h）、0.379±0.011 U/mg（24 h）和46.89±0.60 U/mg（48 h）,这说明在发酵24 h时菌株个关键酶活最大。其二,为了切断乙醇代谢途径,本文采用同源重组技术（SFH-PCR）,分别以质粒p EGFP-C3和p CAMBIA1300基因组DNA为模板,克隆出两边各含40 bp与S.cerevisiae W5中pdc5和pdc1同源的线性片段pdc5-EGFP（949 bp）和pdc1-hy B（1109 bp）,分别以绿色荧光蛋白（EGFP）和潮霉素（Hy B）为筛选标记,通过醋酸锂转化法转入宿主菌S.cerevisiae W5内,使其分别与宿主菌的pdc5和pdc1进行同源重组。采用PCR、q RT-PCR、SDS-PAGE、丙酮酸脱羧酶酶活力测定以及2,3-丁二醇产量等指标验证重组菌株性质,结果表明,重组菌株S.cerevisiae W5-01的pdc5和S.cerevisiae W5-02的pdc1相对表达量在12和48 h均明显低于原始菌株,同比分别降低了49%、30%和53%、55%,而重组菌株bdh1的相对表达量在12和48 h均明显高于原始菌株,分别是原始菌株相关基因表达量的2.50倍、33.59倍和1.67倍、89.88倍;重组菌株S.cerevisiae W5-01的pdc5和S.cerevisiae W5-02的pdc1蛋白灰度值在48 h时比原始菌株同比降低了21.93%和30.1%;重组菌株S.cerevisiae W5-01（0.39±0.1 U/mg）和S.cerevisiae W5-02（0.307±0.1 U/mg）的丙酮酸脱羧酶酶活力比原始菌株丙酮酸脱羧酶酶活力（0.77±0.09 U/mg）分别下降了59.75%和60.13%,2,3-丁二醇产量分别为1.20±0.1 g/L和0.47±0.1 g/L,比原始菌株（0.28±0.07 g/L）分别提高了328.57%和67.86%。本文通过对酿酒酵母pdc5和pdc1的敲除,使更多的碳源流向2,3-丁二醇生成路径,成功为2,3-丁二醇的工业化生产扩大了菌株选择,在一定程度上为实现微生物发酵法生产2,3-丁二醇奠定基础。