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[目 的]探索TGF-β3与BMP-2分别促进PBMSCs成软骨分化的量效关系,进一步探究TGF-β3与BMP-2双因子协同促进PBMSCs成软骨分化的量效关系。[方 法]（1）使用G-CSF与AMD3100双因子动员并采集滇南小耳猪外周血,采用密度梯度离心及贴壁法培养PBMSCs,倒置相差显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测P2代PBMSCs的CD44、CD90、CD34、CD45的表达;分别用茜素红、油红O染色检测P2代PBMSCs成骨、成脂诱导多向分化能力。（2）将获取的P2代PBMSCs体外扩增培养,分别加入不同浓度TGF-β3（2.5ng/ml—500ng/ml）或BMP-2（25ng/ml—1600ng/ml）促进其成软骨分化,并设置空白对照组。于培养第2、4、6、8、10、12、14d时,CCK8检测各组细胞增殖情况。于培养第3、7、14、21d时,收集各组细胞上清液,ELISA检测上清液中Collagen Ⅱ水平。于培养第2ld时,免疫细胞化学染色观察Collagen Ⅱ表达情况;甲苯胺蓝染色观察Aggrecan表达情况。使用重复测量方差分析PBMSCs不同时间点的生长及Collagen Ⅱ变化,找到TGF-β3、BMP-2单因子分别促进PBMSCs成软骨分化的最佳用量。（3）将第二部分实验获得的单因子最佳用量40ng/ml TGF-β3、400ng/ml BMP-2为基础,交叉组合设置9个实验组,与文献常用剂量组合10ng/mlTGF-β3+100ng/mlBMP-2作对比,并设置空白对照组。对P2代PBMSCs分别加入不同浓度成软骨诱导剂诱导成软骨分化。于培养2、4、6、8、10、12、14d时,CCK8检测细胞增殖情况。于培养21d时,RT-qPCR检测SOX-9、CollagenⅡ、Collagen X、Aggrecan、MMP-13 的 mRNA 表达情况。于培养 3、7、14、21d时,ELISA试剂盒检测上清液中Collagen Ⅱ、Aggrecan的蛋白表达水平。于培养21d时,免疫荧光双标检测Collagen Ⅱ、Aggrecan的表达情况。[结 果]（1）G-CSF+AMD3100动员后获取的外周血PBMSCs经培养后呈集落样生长;P2代PBMSCs流式细胞仪结果显示CD34、CD45阴性,而CD44、CD90阳性。经成骨诱导21d茜素红染色显示钙结节形成;成脂诱导14d油红O染色阳性,胞浆内可见脂滴形成。（2）各单因子促进PBMSCs生长曲线大致相似,与对照组各时间点相比均有较显著差异（P<0.05）,随着培养时间延长,各组PBMSCs形态基本相似,呈“S”形。TGF-β3在2.5ng/ml-40ng/ml浓度时,随浓度增加PBMSCs生长增殖能力增强,超过40ng/ml促进PBMSCs生长增殖能力则出现减弱。BMP-2在25ng/ml-400ng/ml浓度时,随浓度增加PBMSCs生长增殖能力增强,超过400ng/ml时PBMSCs生长增殖能力则出现减弱,1600ng/ml浓度时细胞生长活力明显下降,出现细胞毒性作用。ELISA结果显示TGF-β3在40ng/ml、80ng/ml各时间点Collagen Ⅱ含量最高,两浓度组间差异无统计学意义（P>0.05）,同时间点与其他组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。BMP-2在400ng/ml各时间点Collagen Ⅱ含量最高,同时间点与其他组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。甲苯胺蓝染色、免疫组化结果显示诱导21d时TGF-β3在40ng/ml、80ng/ml、BMP-2在400ng/ml时染色强度均明显高于其他浓度组。（3）双因子诱导实验CCK-8细胞增殖结果显示:双因子各浓度组细胞活力组间无统计学差异（P>0.05）,但双因子各浓度组与未加入因子的对照组均有显著性差异（P<0.05）,且双因子各浓度组细胞增殖活力明显优于对照组。RT-qPCR检测软骨相关基因表达结果显示:21d时,对照组、A-E组软骨相关基因（SOX-9、Aggrecan）的表达水平显著低于F、G、H、I、J组,F、G、H、I组显著低于J组,差异均有统计学意义（P<0.05）。对照组、A-E、H、I组软骨相关基因Collagen Ⅱ的表达水平显著低于F、G、J组,F、G组显著低于J组,差异均有统计学意义（P<0.05）。对照组、A-F组软骨肥大相关基因（MMP-13、Collagen X）的表达水平显著低于G、H、I、J组,G、H、I组显著低于J组,差异均有统计学意义（P<0.05）。其中F、G 软骨与骨相关基因（SOX-9、Aggrecan、Collagen Ⅱ、MMP-13、Collagen X）在周期内相对表达量无统计学意义（P>0.05）,显著低于H、I、J组,差异均有统计学意义（P<0.01）。ELISA 结果显示:高于 TGF-β3,40ng/ml+BMP-2,400ng/ml浓度组较低浓度组更能促进PBMSCs分化产生更多Aggrecan、Collagen Ⅱ,但这个趋势并不会随着浓度的再增大而增长。虽然随着因子浓度增高,分化产生Collagen Ⅱ、Aggrecan有所增加,但并无统计学差异（P>0.05）。免疫荧光显示:成软骨诱导培养21 d,对照组Collagen Ⅱ表达呈阴性;A、B、C、D、E组有微弱Collagen Ⅱ表达,但明显少于F、G、H、I、J组;I、J、K组有大量CollagenⅡI表达,明显多于G、H组。Aggrecan与Collagen Ⅱ表达一致。[结 论]TGF-β3在40ng/ml、BMP-2在400ng/ml浓度条件下分别促进滇南小耳猪PBMSCs增殖与成软骨分化的能力最佳。TGF-β3与BMP-2在双因子最佳浓度联合应用可最大化促进PBMSCs成软骨分化,维持软骨表型,而避免其肥大分化。