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猪流行性腹泻、猪轮状病毒病与猪伪狂犬病是严重危害养猪业的三种重要传染病,分别由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪轮状病毒（Rotavirus,PoRV）和猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）引起。PEDV和PoRV主要导致仔猪腹泻,PRV则引起母猪繁殖障碍及新生仔猪急性死亡,并伴有呕吐、腹泻、震颤和运动失调等症状。三种病毒常常混合感染导致更大的危害,为了有效预防和控制这三种疾病,研究一种可同时预防这三种疾病的安全、高效的疫苗显得迫切而必须。本项目拟用PoRV VP7和PEDV S基因的免疫优势抗原区域为目标基因,以PRV XJ株作为活载体,同源重组构建表达PEDV S、PoRV VP7的重组伪狂犬病病毒PRV（CM）株,并开展培养特性、遗传稳定性、安全性等生物学特性研究。1 PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S的构建根据已有文献对PEDV S基因和PoRV VP7基因优势抗原表位的研究,结合生物信息学软件分析,参照NCBI上PEDV和PoRV序列分别设计引物S-a/S-b和VP7-a/VP7-b,在引物上下游5’引入合适的酶切位点、保护碱基和柔性肽序列。RT-PCR扩增出部分VP7和S基因作为本研究的候选基因片段,分别克隆至pMD19-T（Simple）,构建pMD-VP7、pMD-S克隆质粒。对pMD-VP7、pMD-S克隆质粒进行Kpn I、BamH I双酶切反应,回收目的片段连接转化,构建了重组质粒pMD-VP7.S,对该质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定,表明目的基因片段无碱基的突变和缺失,相应酶切位点和柔性肽序列准确引入。对pEGFP-gI28k真核表达载体和pMD-VP7.S重组质粒用Xho I、Sal I双酶切,回收目的片段,连接转化,构建含有VP7.S融合基因的PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S,对该质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。2表达PEDV S和PoRV VP7基因的重组伪狂犬病毒PRV（CM）株的构建将PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S和伪狂犬野毒株PRV XJ株共转染至293T细胞,通过同源重组构建了共表达VP7和S基因并且gI、gE毒力基因缺失的重组伪狂犬病毒PRV（CM）株,经过PCR、Western-Blotting等鉴定,结果表明VP7和S基因成功表达,重组病毒构建成功。3 PRV（CM）株部分生物学特性研究通过将PRV（CM）接种到BHK-21细胞上,增值特性观察发现VP7.S融合基因片段的插入不影响重组病毒株的增值,测定PRV（CM）的TCID50和亲本株相比较,重组病毒株的增值滴度略有降低;一步生长曲线显示重组病毒株和亲本株具有相似的生长动力学;将PRV（CM）在BHK-21细胞传至20代,各代次病毒增殖规律相似;PCR测定显示外源基因稳定存在,毒力基因稳定缺失;安全性试验结果表明,以不同病毒滴度的PRV（CM）接种哺乳仔猪和怀孕母猪,无临床异常是安全的。