奶牛乳腺炎是牛场最常见的疾病之一,给养牛业带来了巨大的损失。迄今为止,使用抗菌药物仍然是大多数牧场治疗乳腺炎的首选方案,但抗生素滥用及抗生素残留对人类及动物健康造成重大威胁。中药治疗乳腺炎在我国有着悠久的历史,中药单体有着较广泛的生物活性同时较难产生耐药性,因此选择中药单体分子治疗奶牛乳腺炎有望作为替代抗生素的乳腺炎治疗方案。藤黄酸(GA)是从藤黄科植物中分离提取的藤黄的主要有效成分。GA具有抗炎、抗菌、调节神经功能,GA因其抗癌作用而闻名,据报道在临床研究中,它能有效地抑制各种癌症,如胃癌和结肠直肠癌等。但没有文献研究GA在治疗乳腺炎中的作用,且GA对乳腺炎的作用及分子机制还不是十分清楚。本研究利用乳腺上皮细胞,研究GA在体外对脂多糖(LPS)诱导乳腺上皮细胞(MMECs)炎症的作用及机制。同时通过乳导管灌注LPS模拟乳腺炎体内模型,研究在体内GA对乳腺炎症、凋亡和血乳屏障的影响,以探讨GA在LPS所致乳腺炎中的作用及其机制。本课题主要研究结果如下:1.GA作用浓度确定根据实验室前期研究结论,对提取的小鼠乳腺上皮细胞培养孔中加入终浓度为1μg/m L的LPS建立刺激模拟体外乳腺炎模型。试验结果表明,1μg/m L的LPS能够引起促炎因子IL-1β,IL-6和TNF-α表达量显著提升(p<0.001)。将10 n M、25 n M和50 n M浓度的GA预孵育小鼠乳腺上皮细胞后加入LPS孵育,检测促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达量,发现三种促炎因子均被不同程度的抑制,且被抑制程度与GA的浓度呈现剂量依赖性关系。同时,通过CCK-8试剂盒检测了对不同浓度GA、LPS及二甲基亚砜(DMSO)对小鼠乳腺上皮细胞活性的影响,试验结果表明10 n M,25 n M和50 n M浓度的GA、LPS和DMSO对小鼠乳腺上皮细胞活性基本无影响。基于此,本实验选择了浓度为10 n M,25 n M和50 n M的GA进行后续实验研究。2.GA抑制LPS引起的小鼠乳腺上皮细胞炎症通过加入LPS和预孵育不同浓度GA模拟乳腺炎和乳腺炎治疗细胞实验。通过RT-q PCR对乳腺上皮细胞中的促炎因子IL-1β,IL-6和TNF-α的表达水平进行检测,结果表明与对照组相比,LPS可显著增加三种促炎因子的表达量(p<0.001)。经不同浓度GA预处理后,IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平出现不同程度的下降,且下降程度与GA的浓度有一定依赖关系。对TLR4及其下游信号通路NF-κB和MAPKs中的相关蛋白进行检测。实验数据表明,GA可以下调TLR4蛋白表达,并对p65和IκB蛋白的磷酸化有一定抑制作用,与LPS组相比能够降低这两种蛋白的磷酸化水平。同样地,MAPKs信号通路中LPS导致的p38,ERK和JNK的磷酸化表达水平也能够被GA不同程度的抑制。RT-q PCR结果表明GA对LPS引起的NF-κB和MAPKs信号通路中p65,IκB,P38,JNK和ERK的m RNA表达有一定的抑制作用。因此,GA可以通过抑制TLR4-NF-κB/MAPKs信号通路以实现其抑制乳腺炎的作用。3.GA通过ROS和MMP抑制LPS介导的小鼠乳腺上皮细胞凋亡在研究GA对LPS导致的乳腺上皮细胞凋亡的实验中,检测了活性氧(ROS)表达水平,线粒体膜电位(MMP)和凋亡相关蛋白表达量。流式结果表明LPS导致ROS的表达量显著提高(p<0.001),而这一现象在加入GA后被逆转,ROS的表达量出现不同程度下降。下一步检测了与ROS密切相关的MMP,通过激光共聚焦显微镜检测发现在加入LPS后乳腺上皮细胞中MMP的稳态被破坏,同时凋亡信号Annexinv FITC增强。而通过不同浓度GA预处理的乳腺上皮细胞中MMP稳态逐步得到恢复,凋亡信号Annexinv FITC也逐渐减弱。通过western blot对相关的凋亡蛋白进行检测,试验结果表明LPS导致的Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量增加的趋势在不同浓度GA组中被抑制,且被抑制的程度与GA呈剂量依赖关系。LPS组中Bcl-2蛋白的表达量与对照组相比显著抑制,GA各浓度组中Bcl-2蛋白的表达量呈现上升趋势。Caspase-3,Caspase-9和Bcl-2的基因表达水平与蛋白表达水平相似,经过LPS处理后乳腺上皮细胞中Caspase-3和Caspase-9的m RNA表达水平大幅增加,而在加入不同浓度GA后Caspase-3和Caspase-9的基因表达水平逐步下降。LPS组中Bcl-2的m RNA表达量则出现明显的下降,而加入不同浓度GA后其m RNA表达水平逐渐回升。4.GA抑制LPS对小鼠乳腺组织的损伤和保护血乳屏障通过对第四和第五乳腺的乳头灌注LPS模拟小鼠乳腺炎模型,并设置不同浓度GA组,24小时后收集小鼠血样和乳腺组织。利用ELISA检测血清中髓过氧化物酶(MPO)和三种促炎因子IL-1β,IL-6和TNF-α的表达量,并对乳腺组织进行病理切片分析和病理学评分。结果表明,LPS组小鼠血清中MPO,IL-1β,IL-6和TNF-α表达量与对照组相比均有显著提升且差异显著(p<0.001)。不同浓度GA组中MPO,IL-1β,IL-6和TNF-α表达量与LPS相比则有不同程度的降低,其中以50μM浓度组的差异最为显著(p<0.001),这表明GA对LPS引起的炎性标志物MPO和促炎因子有较好的抑制作用。病理切片结果显示LPS处理过的小鼠乳腺腺泡结构受到破坏,边缘肿胀,且伴有细胞的肿胀和中性粒细胞的浸润,GA预处理后的小鼠乳腺组织相较于LPS组有不同程度的改善,表现为腺泡结构更加完整,边界清晰和炎性细胞以及血细胞浸润减少等。对乳腺组织切片进行病理学评分发现GA组得分显著低于LPS组病理学评分(p<0.001),表明GA组小鼠的乳腺炎症状得到缓解。对小鼠乳腺组织进行渗透性检测实验,结果表明经过LPS处理后的乳腺组织中腺泡结构受到破坏,血乳屏障的渗透性增加从而导致大量白蛋白渗入到腺泡腔内。但经过GA预处理的小鼠乳腺组织中腺泡结构则相对较紧密,渗入至腺泡腔的白蛋白随GA作用浓度增加而逐渐减少,表明GA组的血乳屏障更为完整。同时通过免疫荧光实验对血乳屏障中Claudin-3蛋白的表达信号进行检测,发现与对照组相比LPS组中Claudin-3蛋白的表达信号大幅减弱,而在中药组中Claudin-3蛋白的信号则随着GA浓度的增加逐渐增强,这表明GA对维护血乳屏障中Claudin-3的表达有着重要的作用。综上所述,GA能通过抑制MAPKs和NF-κB信号通路对LPS所致乳腺炎起保护作用。GA能维护MMP的稳定和减少ROS的过度产生从而抑制LPS诱导的凋亡相关蛋白和基因的表达,同时也能保护血乳屏障的结构。我们的研究结果表明GA可以作为乳腺炎的一种潜在治疗方案,并为临床乳腺炎治疗提供新思路和理论基础。