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沙门菌是一种引起食源性腹泻的常见病原菌,可通过食物、水源进行传播,引发人类急性腹泻甚至死亡。通常,绝大多数沙门菌可以产生硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）,因此,H2S是实验人员初筛与鉴定沙门菌的重要生化指标。近几年H2S阴性沙门菌在世界范围内不断涌现,尤其在我国,H2S阴性沙门菌的流行更为普遍。沙门菌中,phs操纵子编码硫代硫酸盐还原酶,由phsA、phsB、phsC三段基因组成,是沙门菌产生H2S的重要功能基因。研究指出,绝大部分的H2S阴性沙门菌phsA基因发生了不同类型的突变,可能导致了沙门菌H2S表型的缺失。此外,多重耐药（multi-drug resistance,MDR）沙门菌在全球多地涌现。值得注意的是,H2S阴性沙门菌的耐药菌株也多次被研究人员检出。由此可见,沙门菌耐药问题日趋严重。已有研究指出,H2S不仅是细菌硫代谢的副产物,还在细菌耐药过程中发挥重要作用。目前,已在大肠杆菌、沙门菌等多种细菌中证实了这一重要的生物学功能。这不仅表明气体分子作为一种新的耐药方式被人们所认知,而且还揭示了细菌耐药机制的复杂性。然而,H2S作为新的耐药方式调控细菌耐药的分子机理却不得而知。基于全国沙门菌监测平台,本实验室于2006至2013年间共收集到的90株H2S阴性沙门菌。本研究旨在通过对H2S阴性沙门菌遗传变异规律的研究,揭示阴性菌与阳性菌之间的亲缘关系,为我国沙门菌防控策略的制订提供数据参考和科学依据;同时,探究H2S参与调控沙门菌耐药背后可能的分子机制,为耐药菌的治疗提供新的靶点和思路,也为多重耐药沙门菌的治疗和防控提供依据。本研究通过细菌抗生素敏感实验,分析90株H2S阴性沙门菌自身的耐药特点、各血清型的耐药差异以及其与H2S阳性沙门菌在耐药表型上的不同,重点关注耐喹诺酮类药物的沙门菌及多重耐药菌株,为治疗沙门菌感染时合理选择抗生素提供重要科学依据。对21种抗生素敏感实验的结果表明,H2S阴性沙门菌对氨苄西林、替卡西林、庆大霉素、复方新诺明、四环素及氯霉素的耐药率高于H2S阳性沙门菌。而对于头孢类药物、亚胺硫霉素、阿米卡星和氨曲南,H2S阴性与阳性沙门菌均表现出普遍的敏感性。90株H2S阴性沙门菌中,有13株对喹诺酮类药物耐药或者中介耐药,检测发现这些菌株gyr A或par C基因上有关键位点突变。另外,相同血清型的H2S阴阳菌株对同种类的抗生素耐药情况存在差异,包括猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌。值得注意的是,在分离的14种不同血清型的H2S阴性沙门菌中,猪霍乱沙门菌不仅耐药率最高,而且有76%的菌株为MDR菌株。脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）与多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）是研究细菌遗传与亲缘关系的常用方法。我们通过MLST分析将90株H2S阴性沙门菌分为22种ST型别,其中包括两种新的ST型:ST1960和ST1961。H2S阴性鸡沙门菌形成两个克隆群（clonal complex）,CC92与CC1960,而其他血清型的H2S阴性沙门菌分别形成一个CC。山夫登堡、猪霍乱、乙型副伤寒沙门菌的H2S阴阳菌株分别属于不同的ST型。相比于H2S阳性菌,阴性的肠炎、鼠伤寒沙门菌的ST型种类更多,而其它血清型的H2S阴阳性菌株的ST型别相同。通过PFGE分析,47株H2S阴性沙门菌与40株H2S阳性沙门菌按照50%的相似度分为三个聚类组,其中肠炎、乙型副伤寒沙门菌H2S阴阳性菌分别聚类在不同的聚类组中,说明H2S阴性肠炎、乙型副伤寒沙门菌已经形成了不同于阳性菌的进化分支。鼠伤寒、德比、阿贡纳、汤伯逊和火鸡沙门菌的H2S阴阳性菌株分别聚类在同一聚类组里,说明这些血清型的H2S阴阳性菌株亲缘关系密切。分离于上海的H2S阴性鸡沙门菌与分离于广州H2S阴性肠炎沙门菌ST型相同、PFGE带型相似,另外分离于玉溪与上海的H2S阴性甲型副伤寒沙门菌具有相同的ST型和PFGE带型,说明H2S阴性沙门菌存在跨地区传播的可能。此外,分离于家畜的H2S阴性德比、鼠伤寒沙门菌与同血清型的人源阳性菌PFGE带型相似、ST型相同;分离于水源与人源的H2S阴性火鸡沙门菌PFGE带型与ST型完全相同,说明不同样本来源的沙门菌之间亲缘关系密切,提示我们应防范H2S阴性沙门菌通过食物传播给人类或动物。我们利用PCR技术对H2S阴性沙门菌的phs操纵子进行扩增并进行DNA测序,从基因水平揭示沙门菌H2S表型缺失的原因。通过比对phs操纵子序列,发现77株（85%）H2S阴性沙门菌phs基因具有多种突变类型,其中74株（82%）phsA基因发生了突变。phsA基因中主要有三种突变类型:第760位的移码突变、第1087位的移码突变以及第1624位的错义突变;在phsB基因中,主要有四种突变位点:第164位、第314位、第319位及第373位的错义突变;在phsC基因中,主要有两种突变类型:第577位的无义突变和第754位的错义突变。这些突变导致基因产物不完整或氨基酸序列改变,从而可能导致沙门菌失去产H2S的能力。总体来说,H2S阴性沙门菌的phs基因突变的多样性,表明H2S阴性沙门菌phs操纵子序列具有不稳定性,但相同血清型之间phs基因序列趋于稳定。我们利用no-SCAR（Scarless Cas9 Assisted Recombineering）基因编辑技术,成功构建了phsA基因缺失的鼠伤寒沙门菌ATCC14028突变株（ΔphsA突变株）。经沙门/志贺琼脂培养基（SS琼脂）及醋酸铅试纸验证,野生株在SS琼脂上为黑色菌落,而ΔphsA突变株为无色菌落;野生株可使醋酸铅试纸明显变黑,但是ΔphsA突变株却不能。说明ΔphsA突变株无法利用培养基中的硫代硫酸盐产生H2S,不能与指示剂反应生成黑色沉淀。在不同抗生素种类（诺氟沙星、庆大霉素、卡那霉素、四环素）及过氧化氢刺激下,通过对野生株与ΔphsA突变株生长曲线的检测,发现野生株的生长水平显著高于ΔphsA突变株,表明野生株可利用其产生的H2S抵御抗生素的杀菌作用,从而耐药生长。在抗生素或过氧化氢刺激下,野生株内由氧化应激作用产生的ROS显著低于ΔphsA突变株,说明H2S可通过抑制抗生素氧化应激过程中ROS的表达,发挥细菌保护作用,从而使细菌耐药生长。综上所述,本研究通过开展对H2S阴性沙门菌抗生素耐药性及耐药机制研究,发现H2S阴性沙门菌与H2S阳性沙门菌耐药性的差异;对H2S阴性沙门菌与H2S阳性沙门菌的遗传多态性研究,首次发现了两种H2S阴性沙门菌的ST型别,并且发现H2S阴性沙门菌形成了与H2S阳性沙门菌不同的进化分支;对H2S参与沙门菌耐药机制的研究,发现H2S可利用其还原性清除抗生素氧化应激反应产生的ROS,发挥细菌耐药作用。这些研究结果对于沙门菌感染引起疾病时合理使用抗生素、传染源溯源以及有效预防沙门菌传播有重要的科学依据,同时也为以H2S分子作为潜在耐药靶点和细菌耐药的研究提供新的思路。