人源碳酸酐酶II（hCA II）是自然界中催化二氧化碳水合速率最快的酶之一,但由于其热稳定性差,易失活等缺陷严重阻碍大规模工业化应用,本论文将利用分子模拟的手段考察酶的热稳定性和催化活性,对不稳定残基突变在不影响酶活的基础上获取高稳定性以的突变型碳酸酐酶。继而对突变碳酸酐酶进行热稳定性、耐酸碱性、耐阴离子性研究,考察突变型碳酸酐酶在不同条件下的酶活,得到一种高稳定性、高催化活性、可工业化应用的新型碳酸酐酶。本研究主要包括以下内容:（1）碳酸酐酶的体外进化:以人碳酸酐酶为研究对象,利用分子模拟的手段,考察其在不同温度下的热稳定性,确定突变区域。进一步分析氨基酸序列和环境因素对酶的二级结构、生物构象和性质的影响,确定65Ala,198Leu,203Leu,204Leu等被改造残基。对比突变后的碳酸酐酶在不同温度下的回转半径、空腔结构和方均根偏差（RMSD）等参数,确定突变型碳酸酐酶L204K（L204K-hCAⅡ）作为候选突变酶。（2）重组酶的表达和分离纯化:构建突变碳酸酐酶L204K的目的基因,设计引物,克隆目的基因L204K-hCAⅡ,建立包含目的基因pET30a载体,导入大肠杆菌E.Coil BL21进行表达,通过镍柱的分离纯化获得目的蛋白L204K-hCAⅡ。（3）重组碳酸酐酶的酶活研究:采用p-NPA法和电极法饭别检测突变后的碳酸酐酶L204K-hCAⅡ的酯酶活性和CO₂水合活性。结果表明突变型L204K-hCAⅡ的酯酶活性比野生型的提高8倍,并且95℃下也能保存70%的酯酶活性,而野生型hCAⅡ在55℃只保留10%的活性;L204K-hCAⅡ的水合速率提升20%左右,在45℃下保留100%水合速率,在55℃保持50%左右水合速率,而野生型hCA II在45℃的水合速率几乎完全失活,突变后的碳酸酐酶L204K-hCAⅡ热稳定性以及催化活性都有所提高。另外,L204K-hCAⅡ具备较好的阴离子耐受性。