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第一部分在细胞水平研究靶向提高FBP1表达对骨肉瘤细胞相关生物学行为及成骨分化的影响目的:探讨果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)对人骨肉瘤细胞恶性生物学行为即增殖、凋亡、迁移及成骨分化的调控作用。方法:(1)运用q RT-PCR法检测人骨肉瘤细胞MG63、143B及人成骨细胞h FOB1.19中FBP1基因的m RNA表达水平;(2)人骨肉瘤MG63与143B细胞中转染FBP1过表达重组质粒,阴性对照组细胞仅做脂质体转染处理,未经任何处理的MG63与143B作为空白对照组;(3)通过q RT-PCR和western blot法检测FBP1基因的m RNA和蛋白表达水平,以验证FBP1基因过表达效果;(4)通过CCK-8、结晶紫染色、活细胞计数法检测细胞增殖;(5)Annexin V-FITC双染法和DAPI染色法检测细胞凋亡,并通过western blot技术检测凋亡相关蛋白的表达;并运用FCM法检测对细胞周期分布的影响;(6)应用细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞的迁移能力;(7)碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红S染色检测细胞的早期及晚期成骨分化作用。并通过western blot技术检测成骨分化指标Runx2、OCN和OPN的表达情况;结果:(1)人骨肉瘤细胞MG63、143B中FBP1的表达明显低于成骨细胞(差异有统计学意义,p<0.01);(2)在骨肉瘤MG63细胞及143B细胞中过表达FBP1后,FBP1的m RNA及蛋白表达水平均较对照组明显升高(差异有统计学意义,p<0.01),表明FBP1过表达重组质粒转染成功;(3)FBP1过表达组细胞增殖能力较两个对照组明显降低(差异有统计学意义,p<0.01);(4)FBP1过表达后,细胞凋亡率明显增高(差异有统计学意义,p<0.01);(5)三个组间细胞周期没有明显改变,无统计学差异(p>0.05);(6)FBP1过表达组,划痕实验愈合率明显降低(差异有统计学意义,p<0.01),且Transwell实验细胞穿膜数也明显减少(差异有统计学意义,p<0.01);(7)成骨培养基诱导骨肉瘤细胞后,FBP1过表达组ALP染色、茜素红染色阳性,钙盐结节明显增多;成骨相关基因Runx2、OCN和OPN的表达水平增高。结论:FBP1基因在骨肉瘤MG63、143B细胞中的表达明显低于正常成骨细胞;通过转染过表达重组质粒靶向提高FBP1基因的表达可抑制人骨肉瘤MG63、143B细胞增殖,但其增殖并非通过细胞周期调节;FBP1基因的过表达促进其细胞凋亡,同时抑制抗凋亡相关基因Bcl-2的表达;FBP1基因的过表达能够抑制骨肉瘤细胞的迁移;而且促进骨肉瘤细胞的早期和晚期成骨分化能力。第二部分在动物水平研究靶向提高FBP1表达对骨肉瘤作用及其机制目的:通过动物实验进一步验证过表达FBP1基因对骨肉瘤的恶性生物学行为及成骨分化的影响,并探究FBP1通过AKT信号通路对骨肉瘤细胞影响的作用机制。方法:(1)在体内实验中,采用原位成瘤法建立胫骨成瘤的动物模型,分为空白对照组、阴性对照组、过表达FBP1组;(2)运用体外活体成像技术动态观测肿瘤大小及远处转移情况;(3)应用免疫组化实验检测成瘤组织中FBP1、凋亡相关蛋白、成骨相关蛋白的表达水平。(4)通过葡萄糖检测试剂盒、乳酸检测试剂盒测定葡萄糖含量及乳酸分泌量;(5)采用western blot法检测PI3K/AKT信号通路中相关蛋白表达;结果:(1)成功建立胫骨成瘤裸鼠模型,体内实验中各组均成瘤;(2)过表达FBP1组中瘤体体积显著小于对照组,且均未检测到远处转移;(3)免疫组化结果显示,实验组中FBP1的表达成功上调;抗凋亡蛋白Bcl-2的表达低于对照组;成骨分化指标OPN的表达高于对照组。(4)与对照组相比,FBP1过表达组中葡萄糖含量升高,乳酸分泌量降低(p<0.01);(5)过表达FBP1后p-AKT的蛋白表达降低(p<0.01);结论:体内实验结果表明FBP1表达上调后能够使裸鼠成瘤能力下降;并且能够促进骨肉瘤细胞的凋亡和提高其向成骨分化的潜能。过表达FBP1能够改变骨肉瘤细胞的糖代谢,降低肿瘤细胞内的糖的无氧氧化活跃程度,改变了骨肉瘤代谢微环境。而且FBP1基因可能通过PI3K/AKT信号通路发挥对骨肉瘤细胞恶性生物学行为及成骨分化的作用。