细胞色素P4501A1酶在非酒精性脂肪肝的表达和部分作用机制的研究

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非酒精性脂肪肝疾病的发展过程中,氧化应激在非酒精性脂肪肝脂质过氧化作用中起到关键的作用。研究表明,当去除病因(高脂高糖饮食)后,肝脏的脂质积累可自发逆转。芳香受体(Aryl hydrocarbon receptor;AHR)是一种配体激活的转导因子,多环芳香烃化物苯并芘(Benzo[a]pyrene;BaP)是一种广泛认知的AHR激动剂,当激动剂与芳香受体结合后,AHR转移到细胞核的位置与ARNT构成二聚体,继而形成的二聚体与细胞色素P4501A1酶(Cytochrome P450 1A1;CYP1A1)蛋白合成的启动基因连接,激发CYP1A1蛋白的转录和翻译过程。CYP1A1是一种重要的调节活性氧生成的酶。研究显示,CYP1A1在非酒精性脂肪肝中的蛋白表达是升高的,但是其在非酒精性脂肪肝中的起到什么样的作用还不清楚。综合以上的文献,本课题意在说明CYP1A1在非酒精性脂肪肝起到催化脂质过氧化的作用,沉默CYP1A1在非酒精性脂肪肝中的高表达,能够减弱非酒精性脂肪肝中的脂质过氧化作用。为了深化对CYP1A1在非酒精性脂肪肝中作用的探讨,本课题首先检测了CYP1A1在非酒精性脂肪肝进展期及逆转期肝组织中的表达变化。选用人肝癌细胞HepG2细胞株当做体外试验的造模对象,检测CYP1A1在脂质积累逆转实验、蛋白沉默实验和BaP激动实验中的表达变化及作用。1.CYP1A1在非酒精性脂肪肝形成及逆转过程中的变化选择4周大的雄性小鼠30只,体重在20-22 g之间。模型组小鼠给予(Methionine and Choline-Deficent Diet;MCD)饮食4周建立非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease;NAFLD)模型,逆转组小鼠在MCD饮食饲养4周后,中止MCD饮食,正常饲料饲养4周建立脂肪肝自发逆转模型;正常对照组给予正常的饲料(与MCD饲料相对应的阴性饲料)。模型组和逆转组给予正常饲料后0、4周后分别处死小鼠,收集血清、肝脏标本待用。2.CYP1A1-siRNA沉默CYP1A1蛋白表达对非酒精性脂肪肝脂质过氧化的影响HepG2细胞经不同时间点(0、12、24、48h;0.2 mM)和不同梯度浓度的油酸造模液(0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mM;24 h)活化处理后,采用MTT的方法筛选造模液的浓度,Western blot检测CYP1A1在HepG2细胞中的表达变化。结果显示:0.1 mM、0.2 mM、0.5 m M的油酸造模液浓度对细胞的增殖没有明显的杀伤作用,故选用0.2 mM的浓度作为后续实验的造模液浓度。CYP1A1在油酸诱导的HepG2中表达上调,在24 h时的蛋白表达最高。应用CYP1A1-siRNA预处理HepG2细胞后,用试剂盒检测氧化应激指标活性氧(Reactive oxygen;ROS)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase;SOD)。用试剂盒检测脂质过氧化指标丙二醛(Malondialdehyde;MDA)和4-羟基壬烯酸(Hydroxynonenal;HNE)。3.BaP刺激CYP1A1的高表达对非酒精性脂肪肝脂质过氧化的影响将BaP(5μM)溶液加入至油酸诱导/转染后的细胞中继续培养24 h。用试剂盒检测氧化应激指标ROS和SOD、以及脂质过氧化指标MDA和HNE。体内实验结果显示:CYP1A1的表达在非酒精性脂肪肝中显著上升,而在非酒精性脂肪肝自发恢复后表达降低。转染实验结果显示:转染沉默后,CYP1A1的蛋白和mRNA水平较模型组有明显的下降。蛋白沉默后,脂质过氧化指标MDA和HNE的含量有明显的下降,氧化应激指标ROS较模型组有下降,转染后的SOD值较模型组有明显的升高。根据CYP1A2的蛋白和mRNA的结果可以看出转染后的CYP1A2较模型组或正常组没有明显的差异。说明沉默CYP1A1对CYP1A2没有影响,主要是CYP1A1参与油酸刺激的HepG2细胞的脂质过氧化作用。Ba P激动实验结果显示:用激动剂BaP刺激CYP1A1的蛋白表达增加,加重了NAFLD中的脂质过氧化作用。本研究通过体内逆转实验,体外细胞沉默实验和BaP激动实验证明了细胞色素P4501A1酶能够催化非酒精性脂肪肝脂质过氧化作用。
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