目的:立足于蛋白水平,探讨千金子炮制前后对水通道蛋白AQP2、AQP4、AQP8蛋白及mRNA表达的影响;基于iTRAQ技术的定量蛋白质组学研究千金子炮制前后作用于肠道的差异蛋白,为千金子炮制减毒机理研究提供科学依据。方法:1、通过免疫组织化学实验研究千金子生品提取物、千金子霜品提取物、千金子素L1对小鼠结肠部位水通道蛋白AQP2、AQP4、AQP8表达的影响;采用荧光定量PCR法研究千金子生品提取物、千金子霜品提取物、千金子素L1对小鼠结肠部位AQP2、AQP4、AQP8的mRNA表达的影响。2、通过iTRAQ技术联合二维液相色谱及质谱对千金子生品提取物、千金子霜品提取物、千金子素L1作用于肠道组织的差异蛋白进行鉴定,对所有差异蛋白进行生物信息学分析主要包括GO注释、功能富集分析、通路富集分析及相互作用网络分析,最后对筛选的差异蛋白Ang-4及STAT1进行Western blot验证。结果:1、免疫组化结果表明与正常对照组相比,千金子生品、霜品提取物组AQP2、4、8的表达较正常对照组减少,表达具有显著性差异（P<0.05）。与千金子霜品提取物组相比,千金子生品提取物组的AQP2、4、8表达下降,有显著性差异（P<0.05）。荧光定量PCR结果显示,给予小鼠千金子生品提取物及霜品提取物高剂量组后,其结肠组织AQP2、AQP8 mRNA表达均较正常对照组显著降低（P<0.05）,与阳性对照组比较无显著性差异;千金子生品和霜品提取物组结肠组织的AQP4mRNA表达均无显著性差异,但是表达趋势与AQP2、AQP8 mRNA相同;千金子素L1组在结肠组织中AQP2、AQP4、AQP8 mRNA表达与正常对照组及阳性对照组比较并未有显著性差异。2、通过炮制前后不同提取物给予小鼠后,采用基于同位素标记（iTRAQ）的定量蛋白质组学对小鼠肠道的差异蛋白进行分离鉴定。结果显示千金子生品提取物组、霜品提取物组、千金子素L1组分别与正常对照组两两比较后取交集其差异蛋白共计7种,其中上调蛋白2种,下调蛋白5种,取并集后其差异蛋白共计295种,其中上调蛋白225种,下调蛋白70种。通过对差异蛋白的GO分析交集中的7个差异蛋白涉及到的功能生物学过程主要为应激反应、代谢过程,细胞组分主要为细胞部分,分子功能主要为催化活性、分子结合。并集中共得到295个差异蛋白,有166个蛋白涉及到的生物学过程主要有代谢过程、细胞调控、生物调节、应激反应;鉴定到的差异蛋白共有67种对应到的细胞组分主要有细胞部分、细胞器、胞外区、细胞膜等;鉴定到的133差异蛋白对应到分子功能主要有催化活性、分子结合、酶活性调控、结构分子活性等。通路富集分析结果发现不同实验组的通路具有差异性,其中生品提取物组与正常对照组比较后发现活跃程度较高的通路主要以与免疫反应有关的通路为主,还涉及到发育、G蛋白等其他生理过程的通路。千金子素L1组与正常对照组比较后发现活跃度较高的生理过程较为单一,主要集中免疫反应、发育过程,主要信号通路包括白介素信号通路、Ang/Tie2、NF/kB等。霜品组与正常对照组比较后发现活跃度较高的生理过程主要有细胞骨架重构、糖酵解与糖异生等,信号通路主要有B-Raf通路、上皮细胞向间质细胞转变（EMT）相关信号通路、细胞内吞等。通过分析可以看出,千金子生品提取物与千金子素L1多参与机体的免疫反应及发育过程,调控的通路主要是白介素介导的信号通路,包括IL-7、IL-15、IL-23等多种炎性因子。千金子霜品提取物调控的信号通路中虽然也存在白介素等炎性因子介导的炎性反应,但是并不活跃,提示千金子炮制减毒可能与白介素等炎性因子介导的炎性反应降低有密切关系。比较千金子生品与霜品提取物发现共同调控的有G蛋白信号通路、Eph/Ephrin信号通路。与千金子生品提取物相比,千金子霜品提取物调控不同的通路主要有细胞骨架、糖酵解与糖异生等。千金子制霜后肠道毒性作用减弱、利尿作用增强,可能是以上信号通路发挥了重要作用。相互作用网络分析的结果发现,差异蛋白取交集后参与的蛋白相互作用网络是细胞有机体调控过程,仅有Ang-4一个下调的差异表达蛋白参与,网络中NF-κB（转录因子）与其他蛋白的相互作用最密切,提示其在相互作用网络中具有重要作用。差异蛋白取并集后参与的蛋白相互作用网络有通过MHC Ⅱ呈递内源性及外源性抗原肽或抗原性多糖过程,有5个下调及5个上调的差异蛋白参与,网络中MHC class Ⅱ（主要组织相容性复合体class Ⅱ）与其他蛋白的相互作用较密切,提示其在相互作用网络中具有重要作用。差异蛋白取并集后参与的蛋白相互作用网络有应激反应,有3个上调的差异蛋白参与,网络中其中RelA/P65（NF-κB家族）、ubiquitin（泛素）与其他蛋白的相互作用较密切,提示其在相互作用网络中具有重要作用。差异蛋白取并集后参与的蛋白相互作用网络γ-干扰素介导的信号传导及反应,有6个上调及1个下调的差异蛋白参与,网络中其中STAT1（信号转导子与转录激活子1）与其他蛋白的相互作用较密切,提示其在相互作用网络中具有重要作用。Western blot结果显示与千金子生品、霜品及千金子素L1高剂量组Ang-4蛋白的表达量与正常对照组相比均明显降低,有显著性差异（P<0.05）;且生品高剂量组表达量最低,依次为千金子素L1高剂量组、霜品高剂量组,与蛋白质组学结果趋势基本一致;与正常对照组相比,千金子各低剂量实验组Ang-4蛋白的表达量均无明显差异;且随着给药剂量的增加各实验组表达量均降低,说明Ang-4在小鼠肠道组织中的表达可能有一定剂量依赖性。与正常对照组相比,千金子生品、千金子素L1高剂量组给药后肠道组织STAT1蛋白的表达量均明显生高,且有显著性差异（P<0.05）,说明对STAT1蛋白有诱导作用;其中千金子素L1高剂量组表达量最高,依次为千金子生品高剂量组、霜品高剂量组,与前期蛋白质组学结果趋势基本一致;与正常对照组相比,千金子各低剂量实验组STAT1蛋白的表达量均无明显差异,且随着给药剂量的增加各实验组表达量均有不同程度的增加,说明STAT1在小鼠肠道组织中的表达可能有一定剂量依赖性。结论:千金子炮制后对AQP2、AQP4、AQP8蛋白及mRNA的调控作用减弱,进而体现为对肠道粘膜炎症和损伤减弱,肠道毒性降低,这可能是千金子炮制减毒作用机制之一。千金子提取物及千金子素L1作用于肠道组织鉴定的差异蛋白,主要是由细胞部分构成,表达部位多位于细胞内及细胞器,涉及到代谢过程及应激反应过程等,蛋白的信号转导及分子结合功能受到明显影响,实验发现不同实验组的通路具有差异性,千金子生品提取物和千金子素L1多参与机体的免疫反应及发育过程,千金子霜品提取物调控的不同生理过程主要体现在细胞骨架、糖酵解与糖异生等过程。相互作用网络分析提示,千金子可以通过调控多个关键节点蛋白进而调控多条通路作用于机体,可能是由于多组分对机体的共同调控。通过蛋白质组学实验得到的蛋白信息及相关生物学信息,为进一步对千金子炮制减毒的作用靶点及机理研究提供了丰富的实验数据及依据。