RT-qPCR检测双峰驼体内CYP2J基因的分布与表达及其体外表达载体的构建

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:yeah0818
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为探明CYP2J基因在双峰驼各组织中的表达分布情况以及进一步为揭示CYP2J基因与双峰驼抗盐敏感性高血压生物学特性的相关性提供线索,本研究采用实时荧光定量PCR法从mRNA层面检测CYP2J基因在双峰驼各组织中的表达量,并构建双峰驼CYP2J基因的体外表达载体,为后续的蛋白层面的研究奠定基础。根据GenBank中登录的双峰驼CYP2J预测序列(XM006187584)设计引物,选用ACTB作为内参基因,利用SYBR Green I实时荧光定量PCR进行扩增,采用2-ΔΔCT相对定量法处理数据,从基因层面上对双峰驼肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、血管、胰腺等8种组织的CYP2J基因及羊肝脏CYP2J基因的表达量进行检测。结果表明CYP2J基因在双峰驼体内以心脏表达量最高,其表达量显著高于羊肝脏(P<0.01);其次是肾脏、肝脏、小肠、胰腺,而在脾脏、肺脏及血管的表达量极低。本研究应用RT-PCR方法扩增出双峰驼CYP2J mRNA的全长1509bp的完整CDs区,胶回收纯化后,进行TA克隆,使目的基因先连于pMD-18T中并转化于大肠杆菌DH5α的感受态细胞中。经HindⅢ和Kpnl双酶切和质粒PCR鉴定后,扩大培养,并用上述内切酶双酶切重组质粒pMD18-T-CYP2J后,连接于经同样的双酶切的原核表达载体pET-32a,同样转化于大肠杆菌DH5α细胞中鉴定阳性克隆,并经HindⅢ和KpnⅠ双酶切、质粒PCR鉴定及测序鉴定重组质粒是否构建成功。结果表明,在重组质粒pMD18-T-CYP2J和pET-32a-CYP2J双酶切电泳图中均能显示约1500bp的特异性目的条带以及分别于2700bp和5900bp处显示2种质粒的特异条带;以2种重组质粒为模板进行PCR扩增后电泳图均在约1500bp处显示CYP2J特异性条带;并且将测序结果与Genbank中公布的序列进行比对,其相似度为99%。以上结果证明双峰驼CYP2J原核表达载体pET-32a-CYP2J构建成功。因此,通过本实验从RNA层面初步揭示了CYP2J基因在双峰驼主要8种组织内的表达与分布,并成功构建了该基因的原核表达载体,为后续的蛋白层面研究奠定了基础。
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