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奶牛产后子宫内膜炎是子宫内膜的急性炎症,若未及时治疗,则易造成慢性炎症,导致长期不孕。子宫内膜炎导致子宫内膜腺体的损伤、子宫内膜复旧延迟、输卵管内环境改变,引起奶牛产奶量减少、产犊间期延长,淘汰率增加,造成巨大的经济损失。大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)是引起子宫内膜炎的主要致病菌。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是E.coli细胞壁的主要组成成分,参与E.coli在感染宿主过程中的黏附、侵染,并引起组织的免疫反应。NF-κB信号通路在免疫调控和炎症中起重要作用。LPS可作用于细胞Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4),引起核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路的激活,导致下游炎性因子的合成与释放。β-内啡肽(β-endorpin,β-EP)是哺乳动物体内天然生成的具有阿片作用的多肽,β-EP及其受体已被证实存在于子宫内膜基质和上皮细胞中。研究表明,β-EP能够通过NF-κB信号通路抑制炎症,但在子宫内膜先天免疫方面尚无研究。本试验以奶牛子宫内膜基质细胞(Bovine endometrial stromal cell,bESC)为研究对象,探究β-EP对细胞NF-κB信号通路的影响机制。1.单纯β-EP对bESC细胞NF-κB信号通路及其下游炎性因子的影响采用不同浓度β-EP单独处理细胞,通过CCK-8法检测细胞活性变化,荧光定量PCR检测细胞炎性相关基因TLR4、髓样分化因子88(Myeloid differential primary response gene 88,MyD88)、白细胞介素(Interleukin-IL)-1β、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-TNF)-α、IL-6、IL-8、环氧合酶(Cyclooxygenase-COX)-2 与诱导性一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表达变化,Western blot 检测NF-κB通路关键蛋白MyD88、P-p65、p65、P-IκBα、I-κBα的变化。结果表明,0～2.5× 105 pg/mL β-EP 对细胞活性无影响(p>0.05);不同浓度 β-EP(0、20、80、200 pg/mL)处理bESC细胞4、12和24 h,对细胞TLR4、MyD88和炎性因子的基因表达无影响(p>0.05);不同浓度 β-EP(20、80、200 pg/mL)处理细胞 30 min,对 NF-κB 关键蛋白表达无影响(p>0.05)。2.β-EP对LPS诱导的bESC细胞NF-κB信号通路及其下游炎性因子变化的影响试验分为空白组、LPS组(1μg/mL)、LPS与β-EP(20、80、200 pg/mL)共处理组。采用荧光定量PCR检测细胞炎性相关基因的表达变化,Western blot检测NF-κB通路关键蛋白的变化。结果表明,与空白组相比,LPS组细胞TLR4、MyD88和炎性因子的基因表达在4、12和24h升高(p<0.05),NF-κB信号通路关键蛋白水平在30 min 升高(p<0.05);与 LPS 组相比,β-EP(20、80、200pg/mL)和 LPS 共处理组的细胞TLR4、MyD88和炎性因子的基因表达在各时间点均下降(p<0.05),NF-κB关键蛋白水平在30 min下调(p<0.05)。3.阿片受体拮抗剂对β-EP调控NF-κB信号通路及其下游炎性因子的影响试验分为空白组、LPS组(1μg/mL)、LPS和阿片受体拮抗剂共处理组、LPS与β-EP共处理组,和LPS、β-EP与阿片受体拮抗剂(非选择性阿片受体拮抗剂纳洛酮、δ受体拮抗剂ICI 154129和μ受体拮抗剂CTAP)共处理组。采用CCK-8法检测细胞活力,荧光定量PCR检测细胞炎性相关基因的表达变化,Western blot检测NF-κB信号通路关键蛋白表达变化。结果表明,0～2.5 × 105 pg/mL的纳洛酮、ICI 154129或CTAP对细胞活性无影响(p>0.05)。与LPS和β-EP共处理组相比,LPS、β-EP和纳洛酮共处理组的TLR4、IL-8和iNOS基因表达在24 h增加(p<0.05),MyD88、TNF-α、IL-1β、IL-6和COX2基因表达无变化(p>0.05);MyD88蛋白水平和p65磷酸化水平在30min升高(p<0.05),IκBα磷酸化水平无变化(p>0.05)。与LPS和β-EP共处理组相比,LPS、β-EP和ICI 154129共处理组除TNF-α外的所有炎性基因表达在24 h 升高(p<0.05);MyD88 蛋白表达在 30 min 无变化(p>0.05),P-p65/p65 和 P-IκBα/IκBα蛋白表达比升高(p<0.05)。与LPS和β-EP共处理组相比,LPS、β-EP和CTAP共处理组的炎性因子基因表达无变化(p>0.05)。综上,β-EP可抑制LPS诱导的细胞炎症,降低炎性因子的基因表达,抑制NF-κB信号通路的活化。这种抑制作用可被非选择性阿片受体拮抗剂纳洛酮和δ受体拮抗剂ICI 154129所阻断,表明β-EP可能通过δ阿片受体抑制LPS诱导的bESC细胞炎性反应。