金属羧肽酶是家蚕等昆虫消化管中参与饲料消化吸收的关键酶。本文发掘和克隆了一条消化管特异表达的金属羧肽酶（mCp）基因，调查了饥饿和饲料蛋白含量，以及高温和昆虫激素处理对mCp基因表达的影响，并调查了mCp基因敲降处理的影响，以期了解克隆的mCp基因及蛋白质产物对家蚕蛋白质营养消化吸收和家蚕生长发育的影响。主要结果如下:　　 1、家蚕金属羧肽酶（mCp）新基因的全长cDNA克隆　　 利用我们构建的家蚕消化管SAGE表达文库的特异性表达标签Tag（AAATAAAAACTCTATTC），发掘到家蚕EST序列BY926338。以此EST序列为种子序列，使用PCR和RACE方法克隆和验证了一条全长1462bp的cDNA序列，mCp基因包含6个外显子和5个内含子，基因位于家蚕25连锁群的nscaf2818，推导的编码蛋白序列长度为458个氨基酸残基。蛋白序列分析发现mCP的二级结构包含锌金属蛋白结合位点，属于金属羧肽酶类。从构建的昆虫羧肽酶系统进化树分析，新克隆的家蚕金属羧肽酶基因翻译的蛋白质与鳞翅目的黑脉金斑蝶（Danaus plexippus）的羧肽酶A进化关系最接近，羧肽酶活性序列的同源性比对分析表明，不同的物种间，羧肽酶类活性序列中氨基酸残基的保守性较高，无论是高等脊椎动物还是昆虫间都存在较多的氨基酸相似位点。综合克隆以及生物信息学分析结果，初步推断克隆的新基因为金属羧肽酶基因。　　 2、mCp基因在家蚕消化管特异性高表达　　 5龄第3日幼虫全基因芯片表达谱分析结果显示，克隆的mCp基因在大造品种9种组织中的表达水平有显著差异，只在中肠特异性高表达，其它组织中只有痕迹量表达甚至不表达。RT-PCR方法调查结果显示，家蚕mCp基因在黄茧限性Ysh品种5L-3d幼虫的11种组织中，只在中肠特异性高表达，与mCp基因的芯片表达谱结果一致。Western blot分析结果显示，mCP蛋白质只存在于中肠，在丝腺中不存在。RT-PCR方法调查的发育时期表达谱显示，mCp基因在家蚕幼虫食桑期和眠期表达量很高，但熟蚕吐丝开始后表达量迅速降低。暗示mCp基因的表达与幼虫进食存在关联。　　 3、家蚕mCP的功能分析　　 为了探讨mCp基因表达产物与家蚕蛋白质消化和吸收的关系，首先调查了饥饿对消化管中mCp基因表达的影响，结果显示6-72h的饥饿能够下调家蚕5龄幼虫消化管中mCp基因的mRNA水平，饥饿72h后消化管中mCP蛋白质的含量也显著减少;这种饥饿对mCp基因表达的影响能够被复喂所恢复，甚至出现了复喂后mCp基因表达显著的上调现象。说明mCp基因的表达受进食诱导影响，饥饿过程中mCp等消化酶基因的表达受到抑制，复喂后则出现补偿性上调表达现象，这与其它动物中复喂后的补偿生长现象一致。　　 已有报道证明饲料蛋白质含量对家蚕饲料效率等营养吸收指标有显著影响，也直接影响家蚕的生长发育。本实验利用基础人工饲料进行酪蛋白添加，复制出了对家蚕生长发育具有显著影响的模型，利用这一模型观察到，饲料总蛋白含量13.3％至33.3％的范围内，蛋白质含量的增加对5龄幼虫消化管中mCp基因表达有显著上调作用，mCP蛋白质含量也有增加趋势，其中最有效的饲料蛋白质含量是23.3％左右，过高的饲料蛋白质含量对mCp基因mRNA水平和mCP蛋白质含量提高的作用减弱。值得注意的是，饲料蛋白质含量对家蚕雄性幼虫mCp基因的诱导表达作用比雌性作用更加有效，这与家蚕雄蚕的饲料效率高于雌蚕的现象可能有一定关联。　　 进一步调查影响家蚕进食和消化吸收的高温条件对mCp基因表达的影响，结果显示，5龄第3日开始34℃高温环境中，消化管中mCp基因的表达在获得上调表达一段时间后下调，并影响了幼虫的营养吸收和生长;5龄起蚕在38℃高温环境中饲喂，消化管中金属羧肽酶抑制蛋白酶基因的表达量显著上调，并抑制了mCp基因的表达，Ysh品种表现为逐渐死亡。表明高温对家蚕体内mCp基因的表达有影响，并且进一步影响了家蚕幼虫的营养吸收和生长发育。　　 在内源蜕皮激素滴度很低的5龄第3日进行外源20E补充，在诱导了幼虫增龄蜕皮现象的同时，下调了消化管中mCp基因表达量;而保幼激素能够短时间促进消化管中mCp基因的表达。　　 siRNA方法敲降50.4-55.3％5龄第3日幼虫的mCp基因表达量，结果家蚕蛹化时间推迟6d，5龄经过比对照延长了1倍，化蛹率下降了45％。暗示敲降mCp基因表达可能通过影响消化管对蛋白质营养的吸收与转化，从而影响了幼虫至蛹的变态发育。