迄今为止,结直肠癌(Colorectal cancer)仍是我国常见的消化道恶性肿瘤之一,其5年平均生存率约为50%左右,我国每年约有15.9万人死于结直肠癌,死亡率则位居所有癌症死亡原因第五位。目前非转移性结直肠癌治疗仍以手术为核心,除手术之外,美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)治疗指南及中国临床肿瘤学会(Chinese Society of Clinical Oncology,CSCO)结直肠癌诊疗指南推荐进展期结直肠癌病人术后常规进行辅助化疗。然而,辅助化疗对总体生存率提高有限,美国流行病监测及最终结果(surveillance,epidemiology,and end results,SEER)和美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology,ASCO)的研究显示,结直肠癌根治术后的复发率依然高达到30-50%。其中,由于化疗药伴随的强烈副反应,约50%的II、III期结直肠癌病人无法坚持完整的辅助化疗周期。基于此,美国临床肿瘤学会2019年年度进展报告指出尽管化疗对部分病人有利,但是对于其他病人弊大于利,并将“更好地确定能从术后(辅助)治疗中获益的病人群体”列为未来研究重点第二位。寻找特异性的肿瘤分子标记物预测II、III期结直肠癌病人辅助化疗疗效是一直以来结直肠癌研究领域的重要话题,然而目前尚无可临床应用的结直肠癌辅助化疗疗效预测方式。为了寻找能够预测化疗疗效的标志物,学者们进行了众多根据分子标志指导化疗药物选择的研究,但是这些研究结果始终未获公认,存在众多相互矛盾的证据,目前尚无任何单分子标志物可以用来指导辅助化疗。联合使用多个标志物可能能够解决单个分子预测效果不佳的问题,目前此类研究集中于两个方向。一方面,将预后预测模型用来预测化疗疗效,尽管在各自研究中预测效果较好,但这些模型从未得到外部数据证实。同时,预后标志物并不一定能够预测哪些病人能够从更大强度的治疗中获益,“预后标志”不能等同于“预测标志”,使用预后模型预测化疗疗效并无理论依据。另一方面,使用化疗相关稳定细胞系数据进行预测。但是稳定细胞系数据被认为不具有代表性,且其细胞系中化疗敏感性更有可能是对于化疗药物的应激反应,而非生物体内机制性变化。本研究基于结直肠癌芯片分析结果,发现一个4基因预测模型,而这样的化疗疗效预测模型在结直肠癌领域报道较少,仍有较广范的研究价值。本研究对模型进行系统验证,并对比其他预测模型,根据模型预测因子与结直肠癌病理资料、预后及治疗疗效的关系,探索其临床价值。同时,我们尝试阐明4基因与结直肠癌机制联系,为结直肠癌辅助化疗疗效新靶点预测提供理论依据。材料与方法:“训练集”包含来源于GEO(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库GPL570平台的3个芯片数据集(GSE14333,GSE29621,GSE39582),“验证集”包含来自于TCGA(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库测序数据。其中每例手术标本均取自于癌组织,根据临床病理信息完整性进行病例筛选,所有病人术后病理分期均为II、III期且术前未接受过任何形式的放疗或者化疗。根据每例病人接受辅助化疗后是否复发与复发时间将病人分为“辅助化疗获益组”和“辅助化疗不获益组”,使用非参数检验筛选辅助化疗疗效相关差异表达基因。使用KEGG和Reactome预测相关基因富集通路,解释通路相关机制。加入临床病理变量,使用遗传进化算法(genetic algorithm,GA)精确筛选化疗疗效相关因素,将挑选出的变量利用支持向量机(support vector machine,SVM)建立预测模型。标准化表达量数据后,使用决策树模型呈现预测模型决策路线。使用亚群体治疗效果图分析(the subpopulation treatment effect pattern plot analysis,STEPP)挑选化疗疗效预测值最佳cut-off并将验证集中所有病人划分为“预测辅助化疗获益组”和“预测辅助化疗不获益组”,使用Kaplan Meier曲线和log-rank检验对比各组中实际化疗疗效,使用Cox interaction对比预测分组与化疗疗效的相互关系。应用倾向评分(propensity score,PS)对预测结果进行敏感性分析。分析应用验证集数据于相关基因表达序列(Relation expression ordering,REOs)化疗预测模型,对比本模型与REOs化疗预测模型预测效果优劣。结果:1、整合数据集根据GEO数据库的检索结果,我们最终筛选得到共计568例病人作为研究“训练集”。据TCGA数据库检索结果包含138例病人作为研究“验证集”。2、识别辅助化疗相关差异表达基因在“训练集”中依据基因芯片分析结果,共获得240个的化疗疗效相关异常表达的基因(P<0.005)。3、评估模型变量与化疗疗效相关机制通路利用KEGG和Reactiome富集分析(Fisher精确检验,P<0.05),发现在前10个显著相关途径中,“预测辅助化疗获益”高表达基因主要与MAPK和Notch通路相关,而“预测辅助化疗不获益”高表达基因主要与无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)和p53信号通路相关。4、应用人工智能技术建立II、III期结直肠癌辅助化疗疗效预测模型纳入240个差异表达基因与TNM分期作为输入变量,使用遗传进化算法挑选化疗疗效相关变量,最终得到TNM分期和4个差异表达基因(EDEM1,MVD,SEMA5B和WWP2),使用SVM建立预测模型,模型内部验证准确性AUC为0.703。5、预测模型预测效能验证与评价STEPP挑选模型预测值最佳cut-off为0.8,将“验证集”中预测值高于0.8的病例作为“预测辅助化疗获益组”,其余为“预测辅助化疗不获益组”。在“预测化疗获益组”中,接受辅助化疗病人术后无复发转移生存时间(Recurrence-free survival,RFS)显著高于未接受辅助化疗病人(P=0.015,HR=0.345,95%CI=0.140-0.850),而“预测化疗不获益组”中,两者RFS不存在显著差异(P=0.596,HR=1.211,95%CI=0.598-2.454)。对比预测分组变量在内的其他相关变量与化疗疗效关联关系,使用Cox interaction分析后发现,仅模型预测分组变量与化疗疗效存在显著交互关联关系(单因素P interaction=0.028;多因素P interaction=0.011)。6、预测模型与临床病例特征分析按照分期分层分析各病例在“预测辅助化疗获益组”和“预测辅助化疗不获益组”中化疗获益情况,结果发现“预测辅助化疗获益组”中病例全为病理III期病人,而“预测辅助化疗不获益组”中无论是病理II期还是病理III期病人其接受辅助化疗与否RFS无显著差异(II期:P=0.707;III期:P=0.896)。7、决策树模型按照模型预测结果建立决策树模型,模型共包含8个“树干”。当结直肠癌满足病人III期,WWP2>-0.003,MVD>0.167时,其接受辅助化疗从中获益的可能性高达0.875。8、敏感性分析通过PS匹配后,73例“验证集”中的病人被匹配,其中接受辅助化疗的病人与未接受辅助化疗的病人之间临床病理学差异并不显著。在预测“辅助化疗获益组”中,接受辅助化疗的病人比未接受的病人的RFS长(P=0.031,HR=0.300,95%CI=0.094-0.958)。9、对比预测模型与REOs预测模型按照REOs的方法比较了6对辅助化疗相关基因的相对顺序,并将病人分为5-Fu的高/低风险组。无论在5-Fu的预测性高风险组和低风险组中,接受辅助化疗与否不存在显著的RFS差异(高危组P=0.676,低风险组P=0.222)。同样,在接受辅助化疗和仅接受手术的病人中,高风险组和低风险组之间也没有显著的RFS差异(接受ACT的病人P=0.113,仅接受手术的病人P=0.818)。因此,认为基于6对辅助化疗相关基因的REOs预测模型不适合该验证队列。结论:我们成功建立了一个基于机器学习算法的辅助化疗疗效预测模型来预测5-Fu为主辅助化疗对结直肠癌病人复发的影响,模型外推性相比其他预测模型好。该模型可帮助临床医生对适合5-Fu方案的结直肠癌病人进行优化决策,避免化疗对预期无效病人的不良影响。