固定化聚半乳糖醛酸酶制备芒果皮果胶低聚糖及其抑菌活性研究

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我国是第二大芒果生产国,每年会因芒果的深加工而产生大量废弃的芒果皮,芒果皮中含有约15%~20%的果胶,果胶经酶解产生的果胶低聚糖(POS)是一种新兴的功能性低聚糖,具有特殊的抑菌性,可作为新兴的天然防腐剂应用到食品工业。为了实现芒果皮副产物的有效利用,以及POS的高效制备,本课题首先成功固定化聚半乳糖醛酸酶,然后将固定化酶制备成填充床柱式反应器连续水解芒果皮果胶,实现抑菌性POS的高效制备,最后初步探究了POS的抑菌性和抑菌机理,以期为未来工业中果胶低聚糖天然防腐剂的高效制备提供一定的理论依据。主要研究结论如下:首先,采用溶胶-凝胶法固定化聚半乳糖醛酸酶。通过扫描电子显微镜(SEM)、热重分析(TGA)、傅立叶变换红外光谱(FT-IR)、拉曼光谱等对固定化酶进行了表征,并对其最佳反应温度、最佳反应p H、耐热性及重复使用次数进行了研究。结果表明,溶胶-凝胶法成功固定了聚半乳糖醛酸酶,且固定化酶的酶活保留率高达94.6%,说明此方法是一种温和有效的固定方法;在55℃的条件下保温2 h后,固定化聚半乳糖醛酸酶仍保留初始酶活的57%,而游离酶仅保留17%的酶活,说明固定化提高了酶的耐热性;此外,固定化酶还显示出了良好的重复使用性,在循环催化6次后依然保留了65%的初始酶活。其次,利用固定化酶水解芒果皮果胶制备POS,采用牛津杯法测定其抑菌性,并采用高效凝胶过滤色谱(HPGFC)、高效阴离子色谱(HPAEC)、核磁共振(NMR)对芒果皮果胶水解产物进行定量与定性分析。结果表明,芒果皮POS具有抑菌活性,其聚合度为2~8,占果胶水解液的88%。根据NMR的结果证实水解产物的主要结构为半乳糖醛酸(Galp A)通过α-1,4糖苷键构成的聚半乳糖醛酸,即POS。然后,将固定化酶制备成填充床柱式反应器,研究流速、底物浓度、加酶量等关键因素对连续生产POS得率的影响,并通过响应面分析得到最佳生产工艺条件。结果表明通过BOX-Behnken方法得到的回归方程的预测模型可信度高,各因素在实验范围内的影响程度大小为底物浓度>加酶量>流速,分析得到的最佳提取条件为加酶量47.77 U,底物浓度为0.12%,流速为2.2 m L/min,提取率的预测值为96.52%,根据实际情况微调条件后得到的提取率为94.56%。最后,表征芒果皮POS的抑菌性。比较连续化反应得到的POS与市售防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾和Nisin对四种致病菌大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、沙门氏菌(Salmonella)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的抑菌活性,并通过SEM、核酸释放实验初步研究POS的抑菌机理。结果表明,POS的抑菌活性与市售防腐剂相当,其最低抑菌浓度分别为0.8、0.6、1.0和0.8 mg/m L;此外,POS破坏了菌膜的完整性,导致核酸释放,从而影响致病菌的代谢系统,致使菌体死亡。
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