【摘 要】
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乳杆菌是一类具有维持肠道菌群稳态、提高免疫力、拮抗病菌等功能的益生菌,要使乳杆菌可以发挥理想的益生效果,必须保证乳杆菌的数量足够并具有活力。采用真空冷冻干燥技术并加入适宜的冻干保护剂是目前最常用的乳杆菌制剂制备方法。但是冻干保护剂的保护效果具有菌株特异性,同种保护剂对不同种属的乳杆菌保护效果存在很大差异,而要对每一种乳杆菌都进行保护剂的筛选优化显得费时费力。因此,本论文从调节乳杆菌细胞膜组成提高抗
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乳杆菌是一类具有维持肠道菌群稳态、提高免疫力、拮抗病菌等功能的益生菌,要使乳杆菌可以发挥理想的益生效果,必须保证乳杆菌的数量足够并具有活力。采用真空冷冻干燥技术并加入适宜的冻干保护剂是目前最常用的乳杆菌制剂制备方法。但是冻干保护剂的保护效果具有菌株特异性,同种保护剂对不同种属的乳杆菌保护效果存在很大差异,而要对每一种乳杆菌都进行保护剂的筛选优化显得费时费力。因此,本论文从调节乳杆菌细胞膜组成提高抗逆性的角度出发,考察了高冻干存活率乳杆菌的细胞膜脂肪酸组成特点,并探究了多种调节细胞膜组成的方法对乳杆菌冻干存活率及稳定性的影响,在此基础上将多种有效方法组合使用,对制备高活性乳杆菌菌粉具有指导意义。主要研究内容和结果如下:首先探究了高冻干存活率乳杆菌的细胞膜脂肪酸组成特点。使用相同的培养条件培养不同种属的二十四株乳杆菌并收集菌泥,在相同的冻干保护剂及相同的冻干工艺条件下进行真空冷冻干燥。同时使用相同的菌泥,通过镜检统计形态大小,通过硫酸蒽酮法检测荚膜多糖水平,提取并通过GC-MS检测细胞膜脂肪酸组成。挑选出低荚膜多糖水平、形态大小接近的乳杆菌,比较其冻干存活率差异及细胞膜脂肪酸组成差异,探究高冻干存活率乳杆菌的细胞膜脂肪酸组成特点。结果表明,不同种属乳杆菌在相同的冻干条件下冻干存活率有显著差异(33.29%-82.47%),并且冻干存活率较高的菌株具有细胞膜脂肪酸不饱和度较高、平均链长较短的特点。然后选择植物乳杆菌N8作为研究对象,使用各种环境胁迫处理,研究胁迫处理后细胞膜脂肪酸组成与冻干存活率的变化。结果表明,经过各种环境胁迫处理后的植物乳杆菌N8的细胞膜不饱和度、环丙烷脂肪酸比例、平均酰基链长组成发生有规律的小幅度变化,冻干存活率的变化也不大,仅有小幅的提高或下降。另外,植物乳杆菌N8经过胁迫处理后初始活菌数及储藏稳定性都发生了下降。接着,使用不同的外源脂肪酸及吐温对植物乳杆菌N8的细胞膜进行调节,实验表明大多数外源中链、中长链脂肪酸添加后植物乳杆菌N8无法正常生长,无法利用其调节乳杆菌细胞膜组成,只有油酸、吐温80以及吐温20的添加不影响植物乳杆菌N8的正常生长。检测添加这几类脂肪酸类物质使乳杆菌细胞膜脂肪酸组成发生变化并比较乳杆菌冻干存活率,结果表明:添加吐温80后植物乳杆菌N8细胞膜脂肪酸不饱和度从58.64±0.46%提高至79.15%±0.56%,存活率从55.40±3.45%提升至64.84±1.05%;添加油酸提高不饱和度,存活率小幅提高;添加吐温20缩短细胞膜脂肪酸的平均链长,略微提高冻干存活率。进一步通过一些机制明确的能调节细菌细胞膜组成的物质,如多异戊二烯结构的β胡萝卜素、维生素k1(甲萘醌)、角鲨烯;吸附于细胞膜表面,调节膜流动性的氨基酸衍生物褪黑素;还有环糊精、维生素E等可以进入细胞膜、调节细胞膜的物质。通过添加这些物质,检测冻干存活率变化及细胞膜脂肪酸变化。结果发现:这些调节物质对乳杆菌的冻干存活率产生有差异的效果,添加β胡萝卜素、褪黑素后植物乳杆菌N8有较为明显的冻干存活率的提高,从53.97±1.46%分别提高到了68.53±1.79%和72.67±2.32%。添加β胡萝卜素培养后冻干,菌粉在37℃储存2个月后仍有51.30±1.83%的存活率,活菌数3.65±0.11×1011CFU·g-1。最后将有效提高植物乳杆菌N8冻干存活率的调节方式进行组合使用,研究组合使用是否可以增强调节效果进一步提高乳杆菌的冻干存活率,结果表明添加2mg/m L的吐温80、500μg/m L的β胡萝卜素和500μg/m L的褪黑素后,植物乳杆菌N8的冻干存活率从53.97±1.46%提高到86.05±1.27%,大幅提高。使用这些物质培养其他种属的乳杆菌后,冻干存活率均发生了显著提升。
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